云芝多糖对肠道益生菌生长的影响

陈镕坤，池延添，易永旺，邓柳鸿，曾亮，魏奇

1.宁德师范学院生命科学学院（宁德 352100）；2.福建省科技厅产学研合作示范基地（宁德 352100）

益生菌是肠道中的优势菌群。益生菌可以帮助消化食物，抑制肠道内有害细菌的生长，从而维持肠道的微生态平衡[1-3]。青春双歧杆菌是一种有益菌，存在于人体的肠道内，具有预防便秘和恢复肠道菌群平衡等作用[4]。酪丁酸梭菌能够促进肠道内其他有益菌的生长，具有修复损伤的黏膜、抑制病原菌的生长和恢复肠道菌群平衡的作用[5]。嗜热链球菌是酸奶制作的主要菌种之一，可以消化乳糖，对胃酸和胆盐具有耐受性，能够有效改善酸奶品质和机体肠道微环境[6]。植物乳杆菌是食品中常用的乳酸菌之一，能够大量产酸，已有研究表明植物乳杆菌具有免疫调节、抑制致病菌生长和维持肠道内菌群平衡的作用[7]。由此可知，益生菌对保持肠道正常微生物菌群平衡具有重要意义。

云芝（Coriolus versicolor）是一种大型真菌，富含多糖、氨基酸、蛋白质和多种无机盐等物质。云芝的药用价值高，具有降血脂、抗肿瘤、抗衰老、免疫增强和保肝等功效[8-10]。柴新义等[11]研究发现，云芝多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黄曲霉菌具有抑制作用。王星光等[12]研究发现，云芝糖肽具有抗肿瘤的作用，其对抗肿瘤药物具有增敏的作用。王康乐等[13]研究发现云芝多糖具有保肝作用，云芝多糖能够降低酒精性肝损伤小鼠血清中总胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、甘油三酯和天门冬氨酸氨基转移酶水平。

研究以云芝多糖为原料，探究云芝多糖对肠道益生菌生长的影响，并且评估云芝多糖对4种益生菌在体外模拟胃液和体外模拟肠液中的影响。该研究能够为云芝多糖的进一步开发提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 主要材料与试剂

云芝多糖（上海源叶生物科技有限公司）；胰蛋白酶、胃蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）菌株（ATCC8014）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）菌株（ATCC14485）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）菌株（ATCC25755）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）菌株（ATCC15703）：广东省微生物菌种保藏中心；TPY肉汤、TPY琼脂培养基、MC培养基（不含琼脂）、MC培养基、MRS肉汤、MRS培养基、强化梭菌培养基、丁酸梭菌检验培养基：青岛海博生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

HFsafe1200LC生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；UPT-ⅠⅠ-20T实验室超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；DHP-9272A电热恒温培养箱（上海飞越实验仪器有限公司）。

2 试验方法

2.1 菌液的制备

分别取单环菌液（酪丁酸梭菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌）接种至强化梭菌培养基、TPY肉汤、MC培养基（不含琼脂）和MRS肉汤培养基中，在37 ℃条件下厌氧培养24 h，连续活化3代后得到相应活化的菌株。每次试验前，分别取100 μL上述4株菌液（酪丁酸梭菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌）接种至不同的液体培养基。将接种后的菌液置于厌氧培养罐中，在37 ℃条件下厌氧培养24 h。

2.2 生长试验

在无菌条件下，分别取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌）接种至液体培养基中（CK）与添加2%云芝多糖的液体培养基。将接种后的样品保存于厌氧培养罐中，在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养，按预设时间间隔取样，以测定其生长浓度。样品经梯度稀释后，分别吸取0.1 mL稀释液涂布于TPY琼脂培养基、MC培养基、MRS培养基和丁酸梭菌检验培养基平板中，在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h后计数，单位为lg（CFU/g）。

2.3 体外胃肠模拟液的制备

采用0.1 mol/L的磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4）配制不同的液体培养基，用盐酸将液体培养基的pH调至3，在121 ℃条件下高温高压处理15 min。分别取0.5 g胃蛋白酶加入100 mL已灭菌的液体培养基中，即得体外模拟胃液。

采用0.1 mol/L的磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4）配制不同的液体培养基，用盐酸将液体培养基的pH调至7，在121 ℃条件下高温高压处理15 min。分别取1 g胰蛋白酶加入100 mL已灭菌的液体培养基中，即得体外模拟肠液。

2.4 云芝多糖对4种益生菌的影响试验

在无菌条件下，分别取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌）接种至液体培养基中（CK）与分别添加0.5%，1%和2%云芝多糖的液体培养基。在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h，梯度稀释后，分别吸取0.1 mL稀释液涂布于TPY琼脂培养基、MC培养基、MRS培养基和丁酸梭菌检验培养基平板中，其中，TPY琼脂培养基用于测定青春双歧杆菌菌落数，MC培养基用于测定嗜热链球菌菌落数，MRS培养基用于测定植物乳杆菌菌落数，丁酸梭菌检验培养基用于测定酪丁酸梭菌菌落数，在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h后计数，单位为lg（CFU/g）。

2.5 云芝多糖对益生菌在模拟胃液中的耐受性试验

在无菌条件下，分别取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌）接种至体外模拟胃液中（CK）与添加2%云芝多糖的体外模拟胃液。将接种后的样品保存于厌氧培养罐中，在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养0 h和3 h。样品经梯度稀释后，分别吸取0.1 mL稀释液涂布于TPY琼脂培养基、MC培养基、MRS培养基和丁酸梭菌检验培养基平板中，在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h后计数，单位为lg（CFU/g）。

2.6 云芝多糖对益生菌在模拟肠液中的耐受性试验

在无菌条件下，分别取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌）接种至体外模拟肠液中（CK）与添加2%云芝多糖的体外模拟肠液。将接种后的样品保存于厌氧培养罐中，在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养0 h和3 h。样品经梯度稀释后，分别吸取0.1 mL稀释液涂布于TPY琼脂培养基、MC培养基、MRS培养基和丁酸梭菌检验培养基平板中，在37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h后计数，单位为lg（CFU/g）。

2.7 数据处理

采用Excel统计软件进行数据分析，试验的重复次数为3次，并且取3次重复试验的平均值。显著性分析采用SPSS 20软件，P＜0.05表示具有显著性差异。

3 结果与分析

3.1 云芝多糖含量对4种益生菌生长的影响

由图1可知，2%的云芝多糖能够显著增加青春双歧杆菌的菌落数量（P＜0.05）。与CK组相比，随着云芝多糖添加量的增加，青春双歧杆菌的菌落数量也随之增加。与CK组相比，云芝多糖的添加量越高，酪丁酸梭菌的菌落数量也越多。2%的云芝多糖能够显著增加酪丁酸梭菌的菌落数量（P＜0.05）。云芝多糖添加量为2%时，植物乳杆菌的菌落数量与云芝多糖添加量为0.5%和1%的植物乳杆菌的菌落数量没有显著差异（P＞0.05）。云芝多糖不同的添加量（5%，1%和2%）的嗜热链球菌的菌落数量与CK组没有显著差异（P＞0.05）。

图1 云芝多糖含量对四种益生菌生长的影响

3.2 4种益生菌的生长曲线

由图2可知，当培养时间为0～7 h时，云芝多糖处理组中的酪丁酸梭菌的菌落数量与CK组中酪丁酸梭菌的菌落数量相近。当培养时间为12～24 h时，云芝多糖能够增加酪丁酸梭菌的菌落数量。由图3可知，当培养时间为0～24 h时，云芝多糖处理组嗜热链球菌的菌落数量与CK组的嗜热链球菌的菌落数量相近，云芝多糖对嗜热链球菌的菌落数量没有显著影响（P＞0.05）。由图4可知，当培养时间为0～24 h时，云芝多糖处理组与CK组中植物乳杆菌的菌落数量没有显著差异（P＞0.05）。由图5可知，当培养时间为0～1 h时，云芝多糖处理组中青春双歧杆菌的菌落数量与CK组的青春双歧杆菌的菌落数量相近。与CK组相比，当培养时间为3～24 h时云芝多糖能够增加青春双歧杆菌的菌落数量。

图2 酪丁酸梭菌的生长曲线

图3 嗜热链球菌的生长曲线

图4 植物乳杆菌的生长曲线

图5 青春双歧杆菌的生长曲线

3.3 云芝多糖对4种益生菌在模拟胃液中的影响

青春双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌和酪丁酸梭菌在体外模拟胃液中耐受性结果如表1所示。在培养时间为0 h时，添加云芝多糖与未添加云芝多糖处理组的青春双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌和酪丁酸梭菌的菌落数没有显著差异（P＞0.05）。由此可知，初始接种的菌落数量相近。青春双歧杆菌在未添加云芝多糖的模拟胃液中培养3 h后，其菌落数量显著降低（P＜0.05）。云芝多糖处理组的青春双歧杆菌的菌落数量显著高于未添加云芝多糖处理组的青春双歧杆菌的菌落数量（P＜0.05），并且云芝多糖处理组中的青春双歧杆菌的菌落数量与0 h没有显著差异（P＞0.05）。嗜热链球菌在模拟胃液中培养3 h后未能检测出。模拟胃液中添加云芝多糖对植物乳杆菌和酪丁酸梭菌的生长影响不大。由此可知，云芝多糖能够增强青春双歧杆菌对体外模拟胃液的耐受性，而对植物乳杆菌、嗜热链菌和丁酸梭菌的改善作用不显著（P＞0.05）。

表1 4种益生菌在云芝多糖的模拟胃液中的生长情况

3.4 云芝多糖对4种益生菌在模拟肠液中的影响

青春双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌和酪丁酸梭菌在体外模拟肠液中耐受性结果如表2所示。青春双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌和酪丁酸梭菌在模拟肠液中培养3 h，其菌落数量与0 h没有显著差异（P＞0.05）。模拟肠液中添加云芝多糖对青春双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌和酪丁酸梭菌的菌落数量没有显著差异（P＞0.05）。由此可知，模拟肠液中添加云芝多糖对植物乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌和丁酸梭菌的生长无明显的促进作用。

表2 4种益生菌在云芝多糖的模拟肠液中的生长情况

4 结论

云芝多糖具有很高的药用价值，已有研究表明云芝多糖具有保肝、抗氧化、抗肿瘤和增强免疫功能等功效[14-17]。云芝多糖可以作为肠道内的益生菌的营养来源，并且能够促进肠道内益生菌的生长和繁殖。云芝多糖与益生菌结合后，可以提高益生菌的盐耐性和酸耐性，在肠道微生物平衡中起到积极作用[18-19]。研究发现云芝多糖能够增加青春双歧杆菌和酪丁酸梭菌的菌落数量。由此可知，云芝多糖可通过促进青春双歧杆菌和酪丁酸梭菌的生长和繁殖，从而维持肠道内的微生态平衡。通过模拟胃肠液试验发现云芝多糖能够增强青春双歧杆菌在体外模拟胃液中的耐受性。此次研究能够为云芝多糖相关功能性保健品和食品的开发提供理论依据。当然，此次研究关于云芝多糖调节肠道微生物作用机制仍需要进一步的研究。