己烯雌酚快检试纸条制备及其在畜禽肉检测中的应用

朱必婷 ，胡家勇 ，舒方明，周陶鸿，郭青青，汪佳

1.湖北省食品质量安全监督检验研究院（武汉 430075）；2.国家市场监管重点实验室（动物源性食品中重点化学危害物检测技术）（武汉 430075）；3.湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心（武汉 430075）；4.嘉鱼县公共检验检测中心（咸宁 437200）

己烯雌酚（DES，结构式见图1）为人工合成的二苯乙烯类雌激素类药物，曾作为促生长剂被广泛应用于畜牧业。DES对人的生育能力及生殖系统有很大影响，Herbst[1]研究表明，在个体发育的关键阶段DES能够导致组织发生改变，这些改变包括功能性或结构性的病理学改变，并且这种改变具有长期性，甚至会形成肿瘤。另外，Greenwald[2]研究表明DES和阴道癌之间有很大的相关性。Beral等[3]研究结果进一步显示，DES的使用会增加卵巢癌的风险。有研究表明，DES的使用会增加心理疾病的发病概率，主要表现为愤怒、自卑、心理焦虑等[4]。

图1 DES结构式

中国农业部第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中明确指出，禁止将己烯雌酚及其盐、酯及制剂以任何用途用于所有食品动物[5]；农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》明确规定，己烯雌酚禁止用于所有食品动物，在动物性食品中不得检出[6]。然而，部分地区仍将其用作渔业和畜牧业的促生长剂，可在养殖废水和河流中被广泛检出，严重影响水生生态环境的安全，还可能通过食物链的富集作用对人体健康产生威胁[7]。有文献报道[8]，某市城区动检站对市场销售的鸡肉进行己烯雌酚含量检测，从市面上随机抽取40份样品，检测结果显示，40份鸡肉均检出己烯雌酚。鉴于此，开展食品中己烯雌酚的检测显得尤为重要，国内外针对DES残留的检测方法主要有气相色谱-质谱法[9-11]、高效液相色谱法[12-15]、液相色谱-质谱法[16-17]、毛细管电泳法[18-20]、荧光分析法[21-22]、免疫分析法等[23-24]。这些方法存在前处理复杂、仪器昂贵、人员要求高、检测周期长等缺点。

试验研制己烯雌酚快速检测试纸条，开发一种动物源性食品中己烯雌酚快速检测的方法，该方法具有操作简单、灵敏度高、精密度与重复性好、相对干扰少等优点，可满足动物源性食品中己烯雌酚的快速检测。建立动物源性食品中己烯雌酚的快速检测方法，以期为动物源性食品中己烯雌酚现场检测提供一个方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品（市售）。

己烯雌酚抗体、己烯雌酚抗原、羊抗鼠IgG（江南大学）；己烯雌酚标准溶液、己烷雌酚标准溶液、双烯雌酚标准溶液（天津阿尔塔科技有限公司）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钾、氯化钠、吐温20、甲醇、乙醇、曲拉通100、氢氧化钠、二氯甲烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；胶体金（40 nm，上海捷宁生物科技有限公司）；牛血清蛋白（BSA）、酪蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；试验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

HM3030XYZ三维划膜喷金仪、ZQ2002微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公司）；FICM600胶体金荧光免疫分析仪（苏州和迈精密仪器有限公司）；5810离心机、5424R离心机（德国Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 碳酸钾用量

取5支离心管，分别往里面加入1 mL胶体金，4 μL DES抗体，分别加入0，2，4，6和8 μL的0.2 mol/L碳酸钾溶液，2 h后，观察离心管中金标抗体探针的颜色，若仍保持为酒红色，则为最佳的用量以稳定溶液的弱碱性和离子强度。

1.3.2 金标抗体探针的制备

取1 mL胶体金，加入4 μL的1 mg/mL DES抗体，充分振荡摇匀后，静置2 h，加入50 μL 10% BSA溶液封闭，放置2～8 ℃冰箱过夜，所标记的探针按12000 r/min离心15 min，用移液枪吸走上清液，弃去，沉淀用pH 8的Tris-HCl缓冲盐溶液复溶，涡旋摇匀后置于冰箱中于2～8 ℃保存，待用。

1.3.3 单因素试验

以0.2 mmol/L磷酸盐缓冲液（含0.5%吐温）作为检测工作基本液，以牛血清白蛋白（BSA）使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）、海藻糖使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）、乙醇使用量（0.0，1.0%，3.0%，5.0%和10.0%）、氯化钠使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）、酪蛋白使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）、曲拉通100使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）为影响因素，以0和3 μg/L的己烯雌酚标准溶液在试纸条上的T/C信号值为评价指标进行单因素试验，每个因素水平进行3次平行试验。

1.3.4 正交试验

根据单因素试验结果，选出对灵敏度影响显著的3个因素进行三因素三水平的正交试验，因素水平表如表1所示。

表1 L9(33)正交试验设计表 单位：%

1.3.5 试纸条的制备

试纸条组装按照经典的四步法进行[25-26]。取出PVC底板，测量底板每一部分的长度和宽度，进行每一部分原材料适宜宽度和长度的剪裁。接着，将DES-BSA和羊抗鼠二抗用XYZ三维喷金划膜仪划线到NC膜上。将样品垫、NC膜和吸水纸依次组装在PVC底板上，为保证试纸条的流动性良好，在组装时各部分要有一定的重叠，重叠1 mm左右即可，组装完成后立即放入干燥箱中，于45 ℃干燥过夜，干燥完成后切割机切成宽度2 mm的试纸条，为保证试纸条的使用寿命，将制作好的试纸条与干燥剂一同放入铝箔袋中封口保存。

1.3.6 样品前处理

取5±0.1 g绞碎后的样品加入到50 mL离心管中；加入10 mL 20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）涡旋30 s，加入15 mL乙酸乙酯振荡3 min，按3000 r/min离心5 min，上清液为样品液1；取10 mL样品液1用空气吹干仪吹干，吹干后加二氯甲烷200 μL涡旋15 s，加600 μL 1 mol/L NaOH溶液涡旋15 s，按3000 r/min离心5 min，上清液为样品液2；取200 μL样品液2，向其中加入15 μL 6 mol/L磷酸混匀，调pH 7～9，加200 μL检测工作液混匀，作为待测液。

2 结果与分析

2.1 金标抗体探针碳酸钾的最佳使用量

为保障金标抗体探针的稳定性，优化碳酸钾的使用量。在保持其他条件不变的情况下，往1～6号离心管中添加0，2，4，6，8和10 μL的0.2 mol/L碳酸钾溶液，金标抗体探针在过夜后观察其颜色变化，由于1号未添加碳酸钾，出现明显死金的情况，金标抗体探针颜色变为深紫色。2～6号过夜之后可以观察出较为明显的颜色变化，随着碳酸钾的使用量增加，溶液的颜色逐渐变深，但2号离心管的金标抗体探针颜色仍然为酒红色，因此确定制备金标抗体探针碳酸钾的最佳使用量为2 μL。

2.2 划膜浓度确定

由图2可以看出，随着T线划膜浓度提高，T/C信号值呈上升趋势，T线划膜质量浓度0.4 μg/mL时，T/C信号值基本趋于最大值。由图3可以看出，随着C线划膜浓度提高，T/C信号值呈下降趋势，C线划膜质量浓度0.25 μg/mL时，T线显色与C线显色相当，同时T线、C线划膜浓度过低，T线、C线显色过浅，因此确定T线、C线划膜质量浓度分别为0.2和0.25 μg/mL。

图2 T线不同划膜浓度检测结果

图3 C线不同划膜浓度检测结果

2.3 单因素试验结果

2.3.1 BSA使用量

考察不同使用量的BSA对T/C信号值的影响。由图4可以看出，BSA使用量不同，空白溶液的检测结果T/C信号值在1.22～1.35，结果全为阴性，表明BSA对空白溶液的检测影响不大。由图5可以看出，3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果T/C信号值在0.83～0.98，结果虽然全为阳性，没有出现假阴性的情况，但BSA的使用对提升灵敏度并没有效果，不过，BSA的增加组试纸条的显色明显优于未添加组，这是因为BSA的使用可增加检测试剂（金标抗体或抗原）、捕获试剂（抗原或二抗）的稳定性，由于增加检测试剂、捕获试剂的稳定性，从而改善T、C线的显色。综合空白溶液、3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果及试纸条显色情况，BSA使用量选择0.2%。

图4 空白溶液信号检测结果

图5 3 μg/L己烯雌酚标准溶液信号检测结果

2.3.2 海藻糖使用量

考察不同使用量的海藻糖对T/C信号值的影响。由图6可以看出，海藻糖使用量不同，空白溶液的检测结果T/C信号值在1.19～1.43，结果全为阴性，海藻糖对空白溶液的检测影响不大。由图7可以看出，3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果T/C信号值在0.85～0.94，结果全为阳性，与BSA一样，海藻糖的使用对提升灵敏度没有效果，但海藻糖作为还原性单糖具有很多羟基，可以代替水分子与蛋白形成氢键，避免蛋白的变性和疏水区域暴露引起蛋白聚集及沉淀，此外，海藻糖还可改善NC膜的疏水性，利于缓冲液浸润膜，从而改善T、C线显色，故而，海藻糖使用量选择0.2%。

图6 空白溶液信号检测结果

图7 3 μg/L己烯雌酚标准溶液信号检测结果

2.3.3 乙醇使用量

考察不同使用量的乙醇对T/C信号值的影响。由图8可以看出，乙醇使用量不同，空白溶液的检测结果T/C信号值在1.16～1.41，结果全为阴性，但乙醇使用量越大T/C信号值有降低趋势。由图9可以看出，3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果T/C信号值在0.61～0.89，结果全为阳性，但明显可以看出，乙醇的使用对提升灵敏度有一定效果，原因可能是乙醇作为共沉淀剂，可降低蛋白的稳定性，导致蛋白疏水性增强，从而可以增强蛋白与膜的结合，除此之外，己烯雌酚易溶于乙醇，一定体积分数的乙醇可增加己烯雌酚在缓冲液中的溶解性，利于己烯雌酚与实测试剂抗体的结合，因此可以适当改善试纸条的灵敏度。由空白溶液及3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果表明乙醇对试纸条的检测结果影响较大，单因素试验结果表明乙醇的最佳使用量为1%～3%。

图8 空白溶液信号检测结果

图9 3 μg/L己烯雌酚标准溶液信号检测结果

2.3.4 氯化钠使用量

考察不同使用量氯化钠对T/C信号值的影响。由图10可以看出，氯化钠使用量不同，空白溶液的检测结果T/C信号值在1.22～1.41，结果全为阴性，氯化钠对空白溶液的检测影响不大。由图11可以看出，3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果T/C信号值在0.58～0.89，结果全为阳性，但明显可以看出，氯化钠的使用对提升灵敏度有一定效果，随着氯化钠使用量的增加，3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果T/C信号值呈下降趋势，原因可能有两点：一是盐溶效应，对于一些盐溶性蛋白，氯化钠的使用可以增加其溶解性，即降低其在缓冲液稳定性，这样有助于蛋白与检测试剂、捕获试剂的结合；二是盐析效应，盐析作用可适当降低检测试剂的稳定性，有助于检测试剂与待检测分子结合，从而提高灵敏度。由空白溶液及3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果表明氯化钠对试纸条的检测结果影响较大，单因素试验结果表明氯化钠的最佳使用量为0.5%～2.0%。

图10 空白溶液信号检测结果

图11 3 μg/L己烯雌酚标准溶液信号检测结果

2.3.5 酪蛋白使用量

考察不同使用量的酪蛋白对T/C信号值的影响。由图12可以看出，酪蛋白使用量不同，空白溶液的检测结果T/C信号值在1.26～1.38，结果全为阴性，酪蛋白对空白溶液的检测影响不大。由图13可以看出，3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果T/C信号值在0.68～0.89，结果全为阳性，但明显可以看出，酪蛋白的使用对提升灵敏度有一定效果，随着酪蛋白使用量的增加，3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果T/C信号值呈下降趋势，原因可能是酪蛋白作为封闭剂，酪蛋白是一种碱性蛋白，结构紧密，可以形成疏水性表面，降低非特异性吸附，增加信噪比，从而可以提高试纸条的检测灵敏度。由空白溶液及3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果表明酪蛋白对试纸条的检测结果影响较大，单因素试验结果表明酪蛋白的最佳使用量为0.25%～1.0%。

图12 空白溶液信号检测结果

图13 3 μg/L己烯雌酚标准溶液信号检测结果

2.3.6 曲拉通100使用量

考察不同使用量的曲拉通100对T/C信号值的影响。曲拉通100作为表面活性剂，可以改善界面张力，在层析中可以降低NC膜的表面张力，增加缓冲液与膜的浸润性，从而利于抗原和抗体之间的反应，通常可以改善产品的分析性能，比如提高灵敏度、改善T、C线条显色等。由图14可以看出，曲拉通100的使用，空白溶液的检测结果T/C信号值在1.22～1.49，结果全为阴性，曲拉通100的使用对空白溶液的检测影响不大，同时可以降低显色时间。但由图15可以看出，曲拉通100使用量不同，3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果T/C信号值在0.81～1.07，曲拉通100的使用使得3 μg/L己烯雌酚标准溶液的检测结果出现假阴性，说明曲拉通100的使用对试纸条灵敏度具有负面影响。虽然曲拉通100可以降低检测时间，但是对试纸条的灵敏度有负面影响，己烯雌酚在食品动物中为禁用物质，产品的灵敏度是首要考虑的因素，所以，检测工作液中不使用曲拉通100。

图14 空白溶液信号检测结果

图15 3 μg/L己烯雌酚标准溶液信号检测结果

2.4 正交试验结果

GB/T 20766—2006《牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[27]作为畜禽肉中己烯雌酚快速检测方法的参比方法，GB/T 20766—2006规定己烯雌酚的检出限为1 μg/kg，为使快检方法能够到达参比方法的检出限要求，提高试纸条的灵敏度就非常重要，根据单因素试验结果，氯化钠、酪蛋白、乙醇这3个因素会影响试纸条的灵敏度，因此此次试验设计三因素三水平的正交试验，以确定氯化钠、酪蛋白、乙醇这3个因素的最佳使用量，从而提高试纸条的灵敏度，使得己烯雌酚快速检测方法的最低检测限能达到参比方法要求，正交试验的试验结果如表2所示。3号试验结果试纸条的灵敏度最高，检测工作液中氯化钠、酪蛋白、乙醇的使用量分别为2.0%，0.25%和1.0%，此配方下空白溶液的T/C信号值为1.41，阴性检测良好。正交试验的理论最优方案是A2B1C3，是6号试验，其结果试纸条灵敏度低于3号试验，因此3号试验为最优方案。根据单因素试验结果及正交试验结果，确定了检测工作液的配方，即BSA、海藻糖、氯化钠、酪蛋白、乙醇的使用量分别为0.2%，0.2%，2.0%，0.25%和1.0%。

表2 正交试验结果表

2.5 方法学考察

2.5.1 试纸条的检测限

在空白的畜禽肉样本（鸡胸肉、鸭肉、猪后腿肉、五花肉、牛肉、羊肉）中分别添加己烯雌酚标准溶液，含量分别为0，0.5，1.0，3.0和5.0 μg/kg，按照1.3.5进行样品前处理，每个浓度重复3次，根据试验结果确定试纸条的检测限，试验结果见表3。模拟样本中己烯雌酚含量为0和0.5 μg/kg时，试纸条的显示为阴性，即未能检测到样本中含有己烯雌酚，样本中己烯雌酚含量达到1.0 μg/kg时，试纸条显示全为阳性，即能够检测到样本中含有己烯雌酚，因此将试纸条的检测限定为1.0 μg/kg。

表3 己烯雌酚试纸条检测限

2.5.2 试纸条的灵敏度

根据国家市场监督管理总局发布的食品快速检测产品符合性评价中有关灵敏度的技术要求进行试纸条灵敏度的测定。食品快速检测产品符合性评价技术要求目标物为禁用物质时，盲样浓度水平包括空白样品、检出限的1倍浓度水平，每个浓度水平的盲样不少于50份。空白样品以考察快检方法及其产品的假阳性率，检出限1倍浓度水平用以评价快检方法及其产品的假阴性率。

按照食品快速检测产品符合性评价技术要求进行盲样的制备，其中包含50份空白的猪肉样品及含量1 μg/kg的模拟阳性样品。按照1.3.5进行样品前处理，测试方法及产品的灵敏度，测试结果见图16。由图16可以看出，空白样品的结果全为阴性，1 μg/kg的模拟阳性样品的检测结果全为阳性，因此，方法及试纸条的灵敏度为100%。

图16 灵敏度测试结果

2.5.3 试纸条的交叉反应率

根据国家市场监督管理总局发布的食品快速检测产品符合性评价中有关交叉反应率的技术要求进行试纸条交叉反应率的测定，交叉反应率（%）按式（1）计算。

交叉反应率=目标物的检出限/干扰物质检出阳性的最低浓度×100% （1）

将制备的试纸条分别对己烷雌酚、双烯雌酚、苯甲酸雌二醇、己炔雌二醇进行测定，用己烯雌酚试纸条进行交叉反应试验，根据试验结果确定试纸条的交叉反应率，试验结果见表4。己烷雌酚、双烯雌酚的交叉反应率为33.3%，苯甲酸雌二醇、己炔雌二醇交叉反应率＜0.1。

表4 交叉反应率的测定

3 结论与讨论

从金标抗体中碳酸钾用量、T线划膜浓度、C线划膜浓度确定试纸条的研制的相关参数。通过单因素试验、正交试验确定检测工作液配方。此外，从试纸条检测限、灵敏度、交叉反应率3个方面考察试纸条的技术参数是否符合要求。结果显示：试纸条最低检测限为1 μg/kg，与参比方法GB/T 20766—2006《牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》检出限一致，可满足日常畜禽肉中己烯雌酚的快速检测；试纸条灵敏度测试结果为100%；试纸条对己烷雌酚、双烯雌酚的交叉反应率为33.3%，对苯甲酸雌二醇、己炔雌二醇交叉反应率＜0.1，其中，己烷雌酚、双烯雌酚为己烯雌酚的同系物，皆为人工合成的非甾体雌激素物质，其对人体的负面伤害与己烯雌酚较为相似，故而己烷雌酚、双烯雌酚也不应在食品动物中使用，所以当试纸条检测结果呈阳性时可按照相关法律进行暂停销售的处理。