桃过敏原的种类、制备、鉴定及检测技术研究进展

桂沄坤，王锋，马路凯，刘袆帆，王琴，肖更生

仲恺农业工程学院轻工食品学院，农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室（广州 510225）

桃（Prunus persicaL.Batsch）属于蔷薇科水果，在我国具有悠久的种植历史和食用历史，是最常见的植物性过敏食物之一。据欧洲共同体呼吸健康调查结果显示，水果中最容易引发过敏反应的是桃。水果过敏属于I型过敏反应，也称为速发型超敏反应[1]。人接触或摄入过敏原后，可诱导机体产生过敏原特异性免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE），致敏肥大细胞表面的IgE受体可与之结合，从而诱发人体的过敏反应[2]。水果过敏症主要分为轻微口腔反应和全身系统性反应，还会伴有其他症状[3]。同种蔷薇科水果在不同地区引发的过敏症状和严重程度不同，主要引发过敏的蛋白也呈现明显的地区差异性[4]。此外，水果过敏所涉及的交叉反应现象对水果致敏机制和检测技术研究有着很大影响。

水果作为日常生活中的一种必需品，为人体提供多种营养成分，但其诱发的过敏性疾病发病率在全世界范围内不断增加。在北京地区，2019年被诊断为过敏性疾病的804名患者（食物性过敏患者394例）中桃系列的阳性率排名第三，为13.2%[5]。桃过敏症状主要是口腔过敏综合征，其次是荨麻疹、胃肠道症状，以及少数结膜炎等[6]。桃能引起人体产生过敏症状的物质称为桃过敏原，以4类蛋白家族为主，包括病程相关蛋白PR-10、非特异性脂质转移蛋白家族、类甜蛋白家族和抑制蛋白家族。针对不同过敏原可选择不同的分离方法，可采用盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀等对过敏蛋白进行粗提，进而结合多种分离技术进行纯化。利用酶联免疫吸附法、聚合酶链式反应、仪器检测及蛋白印迹法等实现桃过敏原的精准分析。

文章介绍桃过敏原蛋白的种类和生物特性，对其分离纯化及鉴定技术进行总结，并概括现有桃过敏原的检测技术研究进展，以期为桃过敏原的制备、特性分析及致敏机制研究提供依据。

1 桃过敏原的种类及生物学特性

桃过敏原蛋白主要有Pru p 1、Pru p 2、Pru p 3和Pru p 4。基于过敏原数据库检索和文献资料分析，表1总结桃过敏原蛋白的种类、亚型及其生物特性信息。桃主要过敏原结构见图1。

图1 桃主要过敏原结构

表1 桃过敏原蛋白的生物学特性

1.1 桃过敏原Pru p 1

病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PR）是植物受到侵染或者刺激后在处理部位（或者生长部位）诱导产生的一类蛋白质。PR蛋白主要分成17个家族，PR-10蛋白是由多基因家族编码组成，其蛋白质序列高度可变[7]。桃过敏原蛋白Pru p 1属于病程相关蛋白家族，是桃中主要的过敏原，具有易降解且不耐热的特性[8]。Pru p 1蛋白有Pru p 1.0101，Pru p 1.0201和 Pru p 1.0301这3种天然亚型，前两者主要存在桃子果实中，后者主要存在桃子花粉中。Pru p 1.0201与Pru p 1.0101具有相同甚至更强的致敏性[9]，且与免疫球蛋白E的结合能力高于另外两者[10]。在中欧和北欧地区，桃过敏与桦树花粉症密切相关，可能是由于Pru p 1蛋白可与桦树花粉中的过敏蛋白Bet v 1发生交叉过敏，从而导致桦树花粉过敏的人群食用桃子后引起局部的口腔过敏症状。

1.2 桃过敏原Pru p 2

类甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLPs）属于病程相关蛋白第五家族（PR-5），与甜蛋白结构高度相似，是一种抗真菌蛋白[11]。类甜蛋白是由3个结构域形成特殊的折叠结构，其基因可在植物的组织和器官中以不同活性表达，但表达水平与其他过敏基因相比较低[12]。桃过敏原Pru p 2属于该蛋白家族，主要包括Pru p 2.0101，Pru p 2.0201和Pru p 2.0301。Pru p 2.0201是3种亚型中致敏活性最高的过敏原蛋白。Pru p 2.0101属于碱性TLP蛋白，Pru p 2.0201属于酸性TLP蛋白。碱性和酸性的TLP蛋白具有相同的氨基端和96%相同的氨基酸序列，但酸性TLP蛋白直接被驱动到非原质体空间，碱性TLP蛋白在特定应激条件下被运输到液泡[13]。

1.3 桃过敏原Pru p 3

非特异脂质转移蛋白（non-specific lipid transfer protein，nsLTP）属于病程相关蛋白第十四家族（PR-14），在大多数植物性食物中发现可引起交叉反应。nsLTP通常与食物过敏的严重症状有关，可通过口服等多种途径引发过敏[14]。多数nsLTP蛋白具有高度保守的结构，由8个保守的半胱氨酸残基形成4个二硫键[15]，具有较高的热稳定性、蛋白水解稳定性和交叉反应性。桃过敏原Pru p 3蛋白属于非特异性脂蛋白，其蛋白疏水内腔可与一系列不同的配体结合。配体结合影响Pru p 3的羧基端某些保守氨基酸残基的取向，并诱导构象变化，也可以改变过敏原的IgE结合能力，甚至改变其致敏性[16]。不同品种桃中Pru p 3.01含量具有较大差异，Pru p 3.01主要存在果皮、花药和叶片中，在桃果实中富集较少。Pru p 3.02在叶片中含量丰富，Pru p 3.03在花药中含量丰富，但两者在果实组织中几乎不存在。大部分地中海地区的桃过敏人群会对桃Pru p 3蛋白产生过敏反应[17]。Pru p 3最容易被IgE识别而发生交叉过敏反应[18]。

1.4 桃过敏原Pru p 4

多数抑制蛋白（Profilin）分子为12～15 kDa的能够结合肌动蛋白的细胞溶质蛋白，可在特定病毒和所有真核细胞中表达。10%～20%的Profilin蛋白过敏人群会对花粉过敏原有过敏反应[19]。Profilin易被胃蛋白酶水解，具有热不稳定性，可引起口腔过敏综合征[20]。此外，Profilin也被认为是一种潜在的食物过敏原。桃过敏原蛋白Pru p 4属于抑制蛋白家族，其与植物性食物和花粉中的其他致敏性蛋白非常相似，可与Bet v 2蛋白发生交叉过敏反应。其亚基Pru p 4.01可在大肠杆菌中进行外源表达，但表达量不高，与樱桃、苹果等其他蔷薇科水果的基因型比较相近[21]。Pru p 4成员在桃果实的所有组织中均被检测到相近的表达量，而Pru p 4.01在油桃果实组织中的含量比Pru p 4.02高。

2 桃过敏原的制备与鉴定

2.1 桃过敏原制备

盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀等多种提取方法可用于过敏原的分离，采用不同方法均可制备桃过敏原蛋白。表2总结了桃过敏原的分离方法。分离纯化可分为2个步骤：先对桃粗蛋白进行提取，再纯化获得过敏原蛋白。尽管Pru p 1和Pru p 3都属于病程相关蛋白家族，但两者的性质却截然不同，Pru p 1容易被分解，而Pru p 3具有良好的热稳定性。由于不同桃过敏原具有不同的性质，可采取不同方法进行有效分离纯化，并对其进行鉴定分析[22]。由于过敏原在桃果中的含量不高，直接提取分离难度较大，也可采用人工合成过敏原的方法制备大量过敏原蛋白。在获知过敏原蛋白序列的基础上，构建原核生物或真核生物蛋白表达载体，通过诱导宿主细胞产生过敏原蛋白。通过外源表达的方法直接制备过敏原蛋白，重组过敏原具有与天然过敏原相似的生物特性，可用于过敏原的特性分析与致敏机制研究。

表2 桃过敏原的制备方法

2.2 桃过敏原鉴定

过敏原鉴定主要是针对已经被分离纯化出的致敏蛋白分子，利用免疫印迹技术（western blot，WB）分析过敏患者血清中过敏原的分子量区间与免疫活性，针对分离得到的过敏原蛋白，利用有效手段对其进行鉴定分析[26]。液相色谱-质谱联用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）是过敏原分析中最常用的一种仪器分析方法，具有分析速度快及准确性高等特点，被广泛用于食物过敏原蛋白的鉴定，通过质谱分析可以鉴定桃过敏原的蛋白结构、多肽序列、一级结构和分子质量等[27-29]。研究表明，利用LC-MS可以有效分析桃果中Pru p 1和 Pru p 3过敏原蛋白含量，并利用特征肽段的特性高效鉴定出Pru p 3过敏原蛋白，为低致敏桃品种的选育提供依据[30]。有研究建立一种基于液相色谱-串联质谱-多反应监测的桃子过敏原精确定性定量检测方法[31]，利用该方法鉴定3种桃过敏原蛋白的8个生物标志物肽，可用于不同种类桃中过敏原蛋白的精准定量分析。

3 桃过敏原检测技术

基于蛋白质水平和基因水平均可实现食物过敏原的检测分析。利用免疫学方法、生物传感器、仪器检测方法等对食物过敏原蛋白进行定量，也可利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）及基因芯片等实现过敏原特征基因的检测[32]。但两类检测方法均有一定的局限性，且极易受到检测环境因素的干扰[33]。桃过敏原检测方法示意图见图2。

图2 桃过敏原检测方法示意图

3.1 免疫学检测方法

表3总结基于免疫学方法检测桃过敏原蛋白的研究进展。酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）以其操作简单、检测速度快、灵敏度高等优点而被广泛应用于食品安全免疫检测领域[34]。马英桃[35]利用双单抗夹心ELISA方法对桃蛋白进行分析，鉴定8个桃品种果肉和果皮中Pru p 3含量，且果皮中Pru p 3含量高于果肉。免疫印迹法可以检测不同加工食品的蛋白质及多肽[36]，也可用于分析水果过敏原蛋白。金静[23]利用免疫印迹法对天然过敏原蛋白和重组过敏原蛋白进行分析。蛋白质芯片具有特异性高、操作简单及高通量检测等优点，可用于桃过敏原的快速分析[37]。

表3 免疫学方法检测桃过敏原

表4 PCR及其衍生方法检测桃过敏原

3.2 PCR及其衍生方法检测

PCR检测技术包括实时荧光PCR技术（Real-time Quantitative PCR，qPCR）[43]、多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR）[44]、普通PCR及液滴数字PCR（digital droplet Polymerase Chain Reaction，dd-PCR）等[45]，具有灵敏度高、特异性强及复杂体系分析简单等优点。陈琳[46]利用扁桃和桃为亲本杂交的个体作为模板，通过两步PCR法克隆得到桃过敏原基因，共获得35个序列和18个不同的桃过敏原基因，利用qPCR对桃过敏原基因家族成员进行检测，结果发现大部分过敏原在桃果皮和花药中的表达量高于果肉与叶片。对桃过敏原的nsLTP基因进行检测，不同桃过敏原Pru p 3的差异表达与其基因序列相关性不大[35]。qPCR技术可被用于分析过敏原在不同生长时期或不同植物组织中的变化。

3.3 质谱仪器检测

利用质谱鉴定可高效获知过敏原的蛋白序列，不仅可用于对单个食品中的过敏蛋白的分析，还可对复杂基质中多个过敏原进行检测[49]。利用质谱分析过敏原蛋白酶解后的肽段，不仅可模拟胃肠道对过敏原的消化作用[50]，还可用于桃过敏原蛋白的定量检测。通过质谱分析可用于研究桃过敏原蛋白Pru p与IgE结合蛋白的结合特性。

4 结语

桃是日常生活中的一种常见水果，对人体有多种营养功能，但桃过敏却严重影响人体健康和生命安全。文章总结概括桃过敏原蛋白的类别、制备方法、鉴定技术和检测技术的研究进展，然而对桃过敏蛋白的交叉识别特性、致敏机制及不同桃品种中过敏原蛋白的差异性分析等内容的探讨尤为不足，后续可加强这几个方面的研究工作，对桃过敏原的基础研究和检测产品的开发具有重要意义。