乳及乳制品中嗜冷菌多样性的研究进展

孙苗，邵伟，刘政宇，马宪兰，陈贺，赵艳坤,3

1.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室，新疆农产品质量安全实验室（乌鲁木齐 830091）；2.新疆农业大学动物科学学院，新疆肉乳用草食动物营养实验室（乌鲁木齐 8300522）；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部奶及奶制品质量安全控制重点实验室（北京 100193）

嗜冷菌是危害乳品质的主要腐败菌群之一，在原料乳的运输储藏期间嗜冷菌大量繁殖，并产生耐高温的腐败酶，这些腐败酶会水解乳中的蛋白质、脂肪、维生素等营养物质，导致成品乳出现结块、变味、凝乳等现象。现有研究发现原料乳中常见的嗜冷菌有假单胞菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、乳球菌属和微杆菌属等[1-2]。大多数嗜冷菌可以在加工设备上形成生物膜，这些生物膜就充当了微生物的“潜在滋生地”，由于嗜冷菌具有生物转移潜力，会利用生物膜这种天然介质进入乳中，这种方式就成为了嗜冷菌的持久污染源。

近年来，针对乳及乳制品中微生物污染的研究主要集中在细菌的多样性、致病菌的监测控制及腐败菌的快速检测方面，目前国内外关于嗜冷菌多样性的研究热点也在持续增加。Hantsis-Zacharov等[3]研究了4个农场原料乳中可培养嗜冷菌的多样性，结果发现春季和冬季的优势菌为γ-变形菌纲，夏季优势菌为杆菌纲，秋季优势菌为放线菌纲。

嗜冷菌危害一直是制约我国乳制品发展的一大隐患，为了更全面地评估乳中嗜冷菌的污染状况，文章通过对比分析国内外现有检测技术，探究乳及乳制品中嗜冷菌的组成及多样性分布，有助于判定乳及乳制品中潜在的嗜冷菌污染风险，提高乳制品品质、保护消费者的健康。

1 乳及乳制品中嗜冷菌多样性国内外研究现状

长期以来，国内外学者不断在低温环境中分离出大量嗜冷菌，在基础理论研究方面较深入，而对乳及乳制品中的嗜冷菌群落组成及多样性的研究与分析方面还有广阔的研究前景。随着现代生物检测技术日新月异，研究人员也通过这些迭代更新的检测技术在乳品中发现了更多潜在的嗜冷菌新种属，其危害机制也日渐清晰。

1.1 国内对嗜冷菌多样性的研究现状

嗜冷菌是危害乳品质的主要腐败菌群之一，嗜冷菌污染发生在乳制品生产的各个阶段，以往研究也已证实其多样性易受到地域、气候及储藏条件等多种因素影响。国内研究人员通过基因测序等技术的分型鉴定，在牛乳中发现了大量细菌种群，如原料乳中常见的嗜冷菌分布在9个菌纲中，其中γ变形菌纲、芽孢杆菌纲和放线菌纲的富集度最高，每个菌纲会出现18～21个菌种，它们主要分布于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门4个菌门。原料乳的质量决定了乳制品的安全与品质，冷藏时的原料乳也是嗜冷菌的最佳安居之所。杜兵耀[4]对重庆原料乳样品中的嗜冷菌进行分离鉴定，结果发现气单胞菌属、链球菌属、寡养单胞菌属、不动杆菌属是乳中的优势嗜冷菌属。而屠大伟等[5]在重庆另一牧场的原料乳中鉴定出的优势嗜冷菌属为不动杆菌属、芽孢杆菌属和克雷伯氏菌属。不难发现即使是同一地区的原料乳，乳中嗜冷菌主要属的相对丰度却不相同，推断这些差异是由于不同牧场的饲养管理环境，如土壤、饲料、挤奶和养殖设备造成的。也有研究反映出同一动物的不同品种所产动物乳中的嗜冷菌结构也存在差异，例如：马静等[6]对青海地区的牦牛乳微生物进行分离鉴定，结果显示青海牦牛乳中优势菌门为厚壁菌门和变形菌门，从属水平来看，优势菌属为不动杆菌属和乳杆菌属；闫艳华等[7]分析了奶牛养殖场4个关键采奶环节对原料乳细菌多样性的影响，结果发现不同采奶环节奶中细菌种群结构多样性与丰富度差异较大，其中采奶罩杯中的细菌丰度最高，而储奶罐奶中OTU（operational taxonomic unit，OTU）数目最少但嗜冷菌占比最多，可能是由于原料乳在经过低温管道流入储奶罐的过程中其他微生物在低温条件下生长受到抑制，而适应低温环境的嗜冷菌大量繁殖。可见，乳中嗜冷菌的水平和多样性与自然环境、挤奶方法和挤奶设备等整体卫生状况都密切相关。

自19世纪50年代低温保存技术的出现，低温保存成为了抑制乳中微生物污染的一个重要环节。嗜冷菌占初始生乳微生物群的不到10%，而采集的原料乳在投入生产前往往需要4 ℃冷藏一段时间，冷藏过程中嗜冷菌就在微生物群落中占据了主导地位，乳中的嗜冷微生物会产生细胞自身的一些改变和一系列冷应激蛋白的翻译表达，例如利用不饱和脂肪酸、抗冻蛋白、冷休克蛋白以及冷活性酶的产生帮助其实现在低温条件下生长繁殖，保持细菌的生命力[8-10]。经过这些适应过程，嗜冷菌形成了生物膜和群体感应，使其存活率和耐受性明显提升。但是由于每种嗜冷菌在低温环境下的生长特性不同，即使在恒定低温条件下，不同季节或不同地域嗜冷菌的菌群结构也大不相同[10]，研究发现随着冷藏时间的推移，嗜冷菌总数在72 h内可以增加62%左右，冷藏72 h内菌属的丰度由不动杆菌属、链球菌属、无浆体属和梭菌属向黄杆菌属、假单胞菌属和乳球菌属逐渐变化[11]。而王媛媛等[12]的研究结果显示在4 ℃冷藏72 h内不动杆菌属始终是优势菌属，乳球菌属、黄杆菌属和假单胞菌属的占比一直有所增加。整个冷藏过程是一个微生物与乳环境之间动态交互的过程，即使是同一种菌体在不同环境因素的影响下，其所表达的蛋白质也可能有所不同，最终导致其产蛋白酶的能力也不尽相同。卞永霞等[13]通过质谱法从分子水平上对原料乳4 ℃冷藏6 d期间的微生物菌体蛋白质进行相对定量分析，结果发现在整个冷藏过程中相对丰度较高的蛋白质主要来源于假单胞菌属、梭菌属、黄杆菌属和环丝菌属。假单胞菌属所产蛋白质的相对丰度在整个过程中始终占据主要地位（38.39%～42.41%），且在低温储存4 d时达到最高。先前的研究均显示出嗜冷菌群落是一个复杂多变的体系，其中嗜冷菌的多样性取决于动物的泌乳期、储存时间、环境、季节以及初始微生物群落，不同原料乳的嗜冷菌群落结构的变化趋势以及对乳品质的危害程度在各种因素的影响下也不完全一致。

1.2 国外对嗜冷菌多样性的研究现状

乳及乳制品中的微生物群是复杂多样的，其中的微生物多样性及其相互作用已成为研究者关注的焦点。目前国外对动物乳中嗜冷菌的研究主要集中在牛奶加工过程中微生物组成的变化及其对牛奶质量、风味和产品保质期的影响。然而，这些研究大多是针对牛乳进行的，对其他动物乳中嗜冷菌多样性的研究有限。基于嗜冷菌生物膜形成能力的多样性以及营养利用能力的种间差异，导致其在不同乳源中产生了不同生长优势的细菌属。嗜冷菌在不同乳源中分离得到的常见菌属如表1所示。

表1 不同乳源中的主要嗜冷菌属

嗜冷菌的多样性不仅与动物源有关，还与生态环境中温度和湿度等密切相关，这些因素对嗜冷菌的水平及多样性有重要影响。有研究表明秋季与冬季收集的乳及乳制品中嗜冷菌数量明显高于夏季，且其数量介于102～107CFU/mL之间[18-19]。不同的嗜冷菌属具有不同的最适生长温度，这就导致不同季节具有不同的优势嗜冷菌属。Li等[20]的研究结果显示，假单胞菌、丙酸杆菌和黄杆菌的相对丰度较高与低温相关，例如假单胞菌在4至10月平均为12.0%（平均温度为22.8℃），在11至次年3月平均为32.4%（平均温度为8.8℃）；不动杆菌在6至9月平均为19.4%（平均温度为25.7 ℃），在10至次年5月平均为6.0%（平均温度为12.6 ℃），这与Vithanage等[21]的研究结果一致。以上研究都揭示出嗜冷菌的组成结构在一年内的不同季节具有高度的多样性，说明环境因素在塑造乳及乳制品嗜冷菌群的组成中起着至关重要的作用。

2 乳及乳制品中嗜冷菌检测方法

2.1 传统培养法

传统培养法是采用平板牛奶计数琼脂和规定数量的样品，制备倾注平板，并在有氧条件下将平板置于6.5 ℃培养10 d，最终通过观察琼脂平板上获得的菌落数和稀释水平来计算每毫升样品中菌落形成单位。

传统的嗜冷菌培养方法一直是研究乳及乳制品中嗜冷菌菌群结构的“金标准”。由于嗜冷菌生长在特定的环境温度下，通过传统的培养方法能够准确定位嗜冷菌在原料乳菌群中的群落组成，进而再采用分子生物学鉴定手段可鉴定出大多数嗜冷菌分离株至种的分类学水平，从而确定乳中的嗜冷菌种类、水平及其相关生物学信息。这种方法能准确评价乳中嗜冷菌分布水平并得到嗜冷菌菌落的准确计数结果，通过对嗜冷菌株的分离纯化还可以得到单一菌株，为嗜冷菌的后续研究奠定基础，包括嗜冷菌的代谢产物及其所产腐败酶的耐热性等，该方法最终可为探究嗜冷菌对乳制品品质的不良影响及其快速检测方法的建立提供理论基础[22]。

但是，这种传统培养的方法也存在一部分弊端。一方面，嗜冷菌需要在特定的低温条件下培养7～10 d，这就导致从培养到鉴定的时间间隔过长，现有研究证明检测间隔时间的长短会影响乳中嗜冷菌最终的检测结果，样品检测间隔时间越久，最终检测结果往往不具有准确性和说服性。另一方面，传统培养法仅仅能够对嗜冷菌进行分类学地位鉴定，但无法准确测定嗜冷菌在乳品中菌群的相对丰度及多样性分布。

2.2 现代分子生物学方法

近年来，以核酸和蛋白质等物质为检测目标的分子生物学技术蓬勃发展，已被广泛应用于食品微生物检测的各个领域，主要的检测方法有聚合酶链反应检测技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）、酶联免疫、数字环介导等温扩增和荧光原位杂交等技术，这些技术在检测乳及乳制品中微生物时都具有各自的特点[23]，乳及乳制品中嗜冷菌快速检测方法如表2所示。这些方法可以实现对一些难以培养和不可培养微生物的监测，并能获得微生物群落分布结构及相对丰度信息。综合上述，考虑选用传统培养方法和分子生物学技术相结合的方式能够更加全面、准确地描述乳中嗜冷菌群落的相关信息。

表2 乳及乳制品中嗜冷菌快速检测方法

2.3 单分子实时测序

目前实时荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）、酶联免疫技术、数字环介导等温扩增技术和荧光原位杂交等分子生物学技术被广泛应用于鉴定细菌分子，这些方法也经常用于乳制品中嗜冷菌污染的鉴定以及嗜冷菌群落结构的研究。然而，它们仅限于检测特定的目标分类群，不能完整地描述整体的样本微生物概况，并存在检测时间长和不利于群落相关性研究等局限性。高通量测序技术作为新一代分子生物学技术，被广泛应用于环境微生物和食品微生物群落多样性研究中。高通量测序技术又称下一代测序，它的诞生对基因组学研究领域具有里程碑意义，其主要分析过程为：提取样品总基因组DNA，再对目标片段进行PCR扩增，构建测序文库后上机进行高通量测序，最终对得到的数据进行处理并分析微生物群落组成及相关生物学信息[32]。表3为三代主要测序技术的技术核心及技术特点比较[33-35]。

3 结语与展望

嗜冷菌污染已然成为现代乳品加工过程中迫切需要解决的问题，也是制约中国乳制品行业发展的重要因素。乳制品生产中通常用巴氏杀菌和超高温灭菌技术来灭活牛奶中的嗜冷菌，但其产生的热稳定性酶仍具有活性，这些酶会进一步影响乳及乳制品的品质及食用安全性。对此，除了要重视对原料乳生产环境的规范管理，还要加强在乳品加工过程中原料奶的低温贮存和制冷运输技术，以更好地控制乳与乳制品中嗜冷菌的繁殖。

正因如此，建立准确、便捷的嗜冷菌检测方法是有效制定嗜冷菌污染解决措旋的必要基础。目前现有的快速检测方法在具有优势的同时也都存在着一定的劣势，还需要进一步改善。完善、重构嗜冷菌控制软环境体系以降低嗜冷菌污染是未来乳品安全研究的重要方向，更是乳制品全产业链品质保障的有力支撑。