亚临界水提取固相分散萃取净化测定人参中皂苷含量

李建民，莫慧娟，沈海波，康卷娟，刘善鑫，张连钢

甘肃省嘉峪关市食品药品和医疗器械检验检测中心（嘉峪关 735100）

人参是一种多年生的草本植物，分布于我国东北三省地区[1]，被视为极具药用价值的植物，中医学认为其具有非常好的补益作用[2]。这是因为人参所含的多糖、人参皂苷等独特的功效物质[3]。人参皂苷是一种固醇类化合物，具有增强体质、延缓衰老的功效[4-5]。由于人参的独特功效，市场上出现很多人参加工产品，如人参口服液、冻干人参、人参蜜片、人参蜜饯等[6]。然而由于人参产量较低，品质参差不齐，所以高品质的人参产品价格居高不下，不法商家以次充好。所以严格控制人参制品的品质尤为重要[7]。

主要采用的检测方法有分光光度法，需要大孔树脂层析柱净化，香草醛显色测定[8]。该方法可检测总皂苷含量，需要的检测条件较低，但是该方法批间均一度很差；大孔树脂对人参皂苷的吸附能力有限，试验结果的稳定性和准确性很难得到保障。液相色谱法检测的自动化程度高，能检测不同结构的人参皂苷[9-10]，是一种较理想的检测方法，其样品前处理方法为乙醇水溶液回流提取、甲醇回流提取[11]、超声辅助萃取[12-13]等，这对人参提取物制品中皂苷提取效率超过98%；但对人参、人参切片、人参蜜饯等植物基质样品中皂苷的提取效率较低，由于植物细胞壁的保护导致，所以也导致最终检测结果的不稳定性。因此，建立一套高效提取，净化前处理样品，并液相色谱兼容的检测方法很有必要。

亚临界水是处于水的沸点以上，并且体系压力使水仍保持液体状态的水。其具有很多优秀的特点，如亚临界水在实际工作中，可以依靠控制温度范围，使亚临界水呈现不同极性，有利于提取特殊极性范围的目标物[14]。另外一个显著的特点是其拥有较高的离子积，即高浓度的氢离子和氢氧根离子。温度升高到200～300 ℃时，亚临界水中水分子也会电离产生更多的氢离子和氢氧根离子，离子积可达10-11，较常温常压下提高1000倍。更容易与一些路易斯酸碱性物质结合，提高萃取效果[15-16]。同时随着温度的升高，水分子的氢键作用会减弱，氢键数量也会减少，亚临界水的黏度和表面张力随着温度的升高而降低，较低的黏度和表面张力有利于物质的传递和渗透，从而提高提取效率，基于亚临界水的诸多特性，可以考虑用于人参及其制品中人参皂苷的提取工作中。试验结合亲水亲脂材料进行固相分散萃取净化[17-18]，液相色谱检测，建立高效、准确、稳定的人参皂苷检测方法，以期为人参及人参制品的开发、质控提供良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人参样品（通化绿舒堂贸易有限公司）；乙醇（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）；甲醇（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）；人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1（标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；C18填料、PLS填料、PSA填料、大孔树脂（分析纯，杭州微米派科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪（安捷伦1260型，配二级管阵列检测器，安捷伦科技有限公司）；离心机（RX-II型，天美中国科学仪器有限公司）；亚临界水提取系统（5～100 L，鲲华生物技术有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 人参及其制品的样品制备

干燥的人参样品：将样品粉碎过0.300 mm（50目）筛，得到粉状筛下物，筛上物继续粉碎研磨，至全部样品通过50目筛。

新鲜人参样品：将样品粉碎，在均质器中10000 r/min，均质匀浆1 min。

人参蜜饯样品：将样品切成小于5 mm的小块，放入冻干机中，真空冷冻干燥6 h，样品变得疏松，质地变脆。此时将样品粉碎过0.300 mm（50目）筛。

人参提取物保健品，固体样品，粉碎即可；液体样品可直接使用。

1.3.2 亚临界水对人参样品提取压力和温度条件优化

对亚临界水提取肉苁蓉的压力，温度条件进行筛选优化。分别以200，300，400，500和600 kPa这5个压力条件以及150，170，190，210，240，270和300 ℃这7个温度条件，做35组正交试验。每份提取液，检测其中6种人参皂苷化合物含量，以其含量高低，选择最优的提取压力和提取温度作为样品前处理提取条件。

1.3.3 亚临界水对人参样品提取时间优化

在最佳提取温度和压力条件下，分别以1，3，5，7和10 min这5个不同提取时间对同一份人参样品进行提取。每份提取液，检测其中6种人参皂苷化合物的含量，以其含量高低，确定亚临界水对人参样品最佳提取时间。

1.3.4 亚临界水提取

称取5 g制备好的人参样品，精确到百分位。将样品全部放入亚临界水提取反应釜中，加入100 mL蒸馏水，密封好反应釜提取系统，在1.3.2所优化的条件下进行亚临界水提取。提取时间为1.3.3所优化的时间。得到提取液，待净化。

1.3.5 净化材料选择

根据DB22-T 1668—2012《人参食品中人参总皂苷的测定分光光度法》中方法规定使用大孔树脂，自装填柱层析对样品进行净化，检测结果回收率不理想，所以选择十八烷基键合填料（C18）、聚乙烯吡咯烷酮（PLS）、氨基填料（PSA）、大孔树脂作为固相填料。采用固相分散萃取的方式，吸附1.3.4步骤中得到提取液中的人参皂苷。操作步骤：取25 mL提取液于50 mL离心管中，平行做4组试验，分别加入C18、PLS、PSA、大孔树脂各1.0 g。涡旋振荡5 min，按5000 r/min离心3 min。弃去全部上清液，得到离心管底部白色沉淀。向其中加入1.0 g无水硫酸钠和5.0 mL甲醇，涡旋振荡2 min，得到样品待测液。分别测定上清液，待测液。以待测液中目标物含量确定有需要的吸附材料。

1.3.6 吸附时间和解析体积的优化

固相分散萃取需要一定的时间达到吸附平衡。对吸附材料进行解析也需要一定体积适当溶剂确保解析完全。选择1，2，3，4，5，7和10 min这7个不同时间对样品进行提取；选择1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.0和10 mL这7个不同体积甲醇对吸附材料进行解析。以待测液中目标物含量确定吸附和洗脱条件。

1.3.7 提取液净化

将PLS作废固相填料。向25 mL样品提取液中加入1.0 g PLS，涡旋振荡5 min，按5000 r/min离心3 min。弃去全部上清液，得到离心管底部白色沉淀。向其中加入1.0 g无水硫酸钠，5.0 mL甲醇，涡旋振荡2 min，得到样品待测液。

1.3.8 样品测定

将待测液经过0.22 μm滤膜进入液相色谱检测。色谱条件：色谱柱为ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水溶液，检测波长202 nm；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL。分别称取人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀待用。用甲醇稀释至1.0～100.0 μg/mL的标准系列溶液。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到校准曲线。含量按式（1）计算。式中：X为目标物含量，g/kg；c为由标准曲线校准得到的样品液中目标物含量，μg/mL；V为样品液体积，500 mL；m为样品质量，10.0 g；1000为毫克与微克的换算系数。

2 结果与讨论

2.1 亚临界水提取人参样品的压力和温度条件优化试验结果

35组棋盘试验结果以曲面图表示，如图1所示。

图1 不同提取压力和温度下提取液中人参皂苷含量

亚临界水提取人参样品，温度和压力升高，有利于提高亚临界水提取人参皂苷的效率。得到提取液中人参皂苷含量升高。压力≥400 kPa且温度≥240℃时，Rg1、Re、Rb1达到最大提取效率；压力≥400 kPa且温度≥190 ℃时，Rc、Rd、Rb2达到最大提取效率。压力≥600 kPa且温度≥210 ℃时，Rg1、Re、Rb1达到最大提取效率；压力≥500 kPa且温度≥170 ℃时，Rc、Rd、Rb2达到最大提取效率。综合考虑，反应体系中压力增加带来的成本增加远高于升高温度的成本，所以，考虑在完全提取的前提下，压力和温度折中的条件为最有提取条件，所以最终提取压力400 kPa、提取温度240 ℃。6种不同人参皂苷需要的提取温度和压力存在差异：一是因为每种皂苷在样品中含量不同导致，含量较多的3种皂苷Rg1、Re、Rb1，不容易被提取，需要的条件更苛刻；二是因为每种皂苷结构差异，亚临界水对不同结构的物质提取效率和条件也有所差异。

2.2 亚临界水提取人参样品所需时间优化

不同提取时间对提取效率的影响如图2所示。

图2 不同提取时间6种人参皂苷含量

随着提取时间增加，亚临界水对人参皂苷的提取效率也随之增加。但提取时间超过5 min时，提取效率到达最大效果，继续增加提取时间只会增加提取成本，皂苷含量不再增加。所以亚临界水提取时间选择5 min。由于亚临界水低极性和高离子积的特点，可以提高对目标物的溶解度。同时，在高压环境下，人参样品很容易被破坏，内部所包含的目标物能快速溶解到亚临界水中。所以整个提取过程可在短时间内完成。相比文献[11,13]中记载的1 h和30 min，提取效率有大幅提高。所以亚临界水用于人参皂苷的提取试验中，无需有机试剂，短时间内可以完成提取过程，更加快捷稳定，有利于后续净化和检测试验的进行。

2.3 固相分散萃取材料的选择

不同的萃取填料对人参皂苷的吸附和解析效率存在很大差异。根据1.3.5步骤得到的试验结果如表1和表2所示。

表1 不同填料对人参皂苷的吸附效果影响

表2 不同填料对人参皂苷的解析效果影响

由表1可知，经C18填料、PSA填料、大孔树脂吸附残留的上清液中仍然含有大量的目标化合物。而PLS填料吸附后上清液残留量明显低于3种填料。说明PLS在短时间，简单涡旋振荡操作条件下，即可对皂苷化合物到达高效率吸附。由表2可知，利用5 mL甲醇对吸附后的C18填料、PSA填料、大孔树脂填料进行解析，无法完全解析，有部分目标物仍然残留在填料中，无法满足对化合物检测回收率要求，而PLS填料在少量有机溶剂条件下，即可完全解析。完全满足后续检测要求。这是因为，C18填料和大孔树脂对大部分有机化合物都有吸附效果，但吸附效率较低，需要在柱层析的条件下，多次吸附，才能达到吸附平衡。同理，在解析过程中，仍需要多次洗脱才能达到最优效果。所以该填料不适合作为固相分散萃取的填料。PSA填料对糖类，苷类等化合物有高效吸附特性，但是必须在乙腈条件下吸附效果才能达到最高，所以不适用于本试验亚临界水条件下的分散萃取。而PLS填料对水溶液中的含羟基的化合物有非常强的吸附能力。正好与试验中采用的亚临界水条件有极好的兼容性。

2.4 6种人参皂苷色谱行为

亚临界水提取，PLS固相分散萃取，高效液相色谱检测人参样品中6种皂苷，色谱图如图3所示。

图3 6种皂苷液相色谱图

由图3可知，6种保留时间分别为4.191，4.687，6.006，6.943，8.036和9.462 min，此液相色谱仪空气保留时间为1.515 min。色谱峰理论塔板数按式（2）计算，分离度（R）按式（3）计算。

式中：tR为目标色谱峰的调整保留时间，即目标峰保留时间与空气保留时间之差，min。W1/2为半峰宽。

式中：tRi为目标色谱峰的调整保留时间，min；Wi为目标色谱峰拐点峰宽。由数据可以计算出色谱峰的理论塔板数和分离度。计算结果如表3所示。

表3 目标物色谱峰理论塔板数和分离度计算结果

由表3可知，Rg1、Re、Rc、Rb1、Rb2、Rd的理论塔板数分别为5622，5924，10532，12559，15571和22392，液相色谱要求理论塔板数大于5000，所以6种目标物峰形对称，满足色谱分离要求。分离度均大于1.5，所以目标物色谱峰分离度良好，满足色谱分离要求。

2.5 检测方法的回收率和精密度

在人参样品中加入6种标准物质，并做3组平行样品。验证方法回收率和精密度，结果如表4所示。

表4 实际样品回收率及SRSD值试验结果

由表4可知，该方法6种目标物的回收率分在90.59%～99.06%。SRSD≤3%，证明该方法结果准确、稳定，满足检测要求。由于本方法采用亚临界水提取目标物，PLS填料分散萃取的方法处理样品。相比文献[11]比色法和文献[13]液相色谱法回收率95%～99%相当，试验方法操作更简单，步骤更少，导致目标物散失的因素更少，目标物分子适中保存在样品提取液中，没有加热，蒸馏，转移，萃取等影响检测结果准确性的试验步骤。所以最终结果完全满足准确度和精密度要求。

2.6 检测方法检测浓度范围和检出限

以线性范围评价该方法的检测浓度范围，当3倍信噪比对应的浓度为仪器检出限，以最低检出限评价该方法灵敏度，结果见表5所示。

表5 线性范围及方法检出限

由表5可知，6种目标物均有较宽的线性范围，5～500 μg/mL的线性范围，对应0.02～4.0 g/kg的检测范围，满足各类样品中人参皂苷的检测。由于试验方法采用高倍浓缩，所以方法检出限数值很低，满足微量检测要求。对部分皂苷含量较少的样品液适用。

2.7 实际样品检测

利用所建立的方法，对新鲜人参，人参切片，西洋参含片，人参蜜饯样品进行检测。检测结果如表6所示。

表6 实际样品检测结果

3 结论

亚临界水与样品在料液比1∶20（g/mL）、压力400 kPa、温度240 ℃条件下，仅需要提取5 min，能将人参样品中人参皂苷提取到提取液中，较超声提取，回流提取有明显优势，同时亚临界水提取更加绿色、环保。在此基础上利用PLS填料对提取液中目标物进行分散萃取，将目标物快速高效的富集在填料上。用少量有机试剂解析，PLS填料对水溶液中的人参皂苷具有极强的吸附能力，而甲醇对PLS中的人参皂苷也有极强的洗脱能力。这样的现象确保该样品前处理方法的快捷、简便、高效、准确、稳定等特性。试验所建立的亚临界水提取，PLS固相分散萃取富集净化处理人参样品，通过液相色谱检测方法具有良好的准确性，稳定性、灵敏度和检测范围。试验操作步骤简单，短时间内可完成检测试验得到检测结果，适用于各类含有人参皂苷的样品。该方法的建立也为亚临界水在检测领域的应用拓宽思路，也为固相分散萃取的应用提供一定试验基础。