木桶发酵酱油挥发性风味物质研究及体外降压活性分析

熊思瑞，王云峰，张智勇，乔祺，周明印，金铁岩

延边大学农学院（延吉 133002）

酱油是一种传统的发酵调味品，一般由大豆和小麦粉经过长达数个月的酶促酿造而成，可用于提高食品的风味和口感。大多数亚洲国家，特别是在中国、日本、韩国和泰国的各种肉类菜系中都被用于腌制和调味主要是因为东方食品消费量的增加[1]。酱油在中国历史的长河中流长久远，由于中国人民生活习惯大相径庭，在酿造酱油所使用的原料及加工工艺上也都大不相同，甚至因为地域不同也能在产品的品质方面感受到差异[2]。

天然发酵酱油中各种化合物超300种，而其中挥发性香气成分占比90%左右，由此可知挥发性香气成分对酱油成分贡献之大[3]。酱油在发酵过程中或者是通过艾利希（Ehrlich）途径从氨基酸中产生丙醇和散发出玫瑰香的苯乙醇等高级醇[4-6]，各种醇类化合物相互协作也可以提升酱油的风味[7]。通过一些催化发生还原反应产生能够使酱油的味道变得柔和挥发性酯类[8]，并协同一些高级醇使气味更为醇厚[9]。乙醛作为酵母与酒精发酵的中间代谢物与硫醇缩合产生芳香醛类化合物，能使酱油的味道更为复杂[10]。酮类中研究最多的呋喃酮类物质是通过酵母代谢而产生的HEMF，这种呋喃酮类物质可以使酱油具有特殊的焦香气，除了可以增加味觉同时还兼具抗肿瘤活性[11-13]。具有代表性的挥发性酚类为具有丁香和烟熏味的4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚，其调节咸味的能力可使酱油的口感更加柔和[14]。戊糖与氨基酸置换会生成有坚果香及烘烤香吡嗪类化合物[15]。各个化合物间相互协作赋予酱油独特的香气。

脑出血与高血压等心脑血管疾病的诱因之一就是血管紧张素转化酶（ACE），人体血浆中高浓度的ACE可能会引发血管的病变以及血管壁增殖。将血管紧张素Ⅰ型转变为血管紧张素Ⅱ型是ACE酶的主要作用，ACE酶抑制剂能阻止已报道最高内源升压肽血管紧张素Ⅱ的生成[16]。酱油在发酵期间由于微生物的作用会将大豆蛋白质分解成大豆多肽等若干低聚肽类。抑制ACE酶是大豆多肽最主要的一个生理活性功能。研究表明，大豆多肽的降血压作用机制是它们抑制由血管紧张素转换酶催化的血管紧张素Ⅰ向血管紧张素Ⅱ的转化，从而防止血管末端收缩产生降压作用[17-18]。

为提高国产酱油的品质、提高国产优质酱油在国内调味品市场的竞争力，研究木桶发酵酱油挥发性风味物质并分析并研究其生理活性。利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪对1组木桶发酵酱油与5组玻璃纤维发酵罐发酵酱油中挥发性风味物质进行分离，鉴定、定性分析及计算出6组供试酱油中各个挥发性风味化合物的相对含量，比较酱油不同酱油在挥发性物质上存在差异，并结合电子鼻对6组供试酱油进行分析。通过体外降血压试验，进一步评价木桶发酵酱油对血管紧张素转化酶（ACE）的抑制作用，比较不同发酵容器发酵酱油在功能性方面的差异，旨在生产具有良好香气和口感的优质酱油、或功能性酱油提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

木桶发酵酱油由好记食品酿造股份有限公司提供（代号S1）；其余5种均购于延吉市百货大楼超市（代号分别为S2、S3、S4、S5、S6）。试验所用酱油试样信息如表1所示。

表1 6组酱油的基本信息

DB-wax毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；超纯氦气（体积分数≥99.99%）；无水乙醇（分析纯），购自天津科密欧化学试剂有限公司；马尿酰-组氨酸-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）标准品、血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE），购自Sigma公司；马尿酸（Hippuric acid，HA）标准品，购自上海源叶生物科技有限公司）；乙腈、三氟乙酸、三乙胺、氯化钠（均为色谱纯），硼酸、四硼酸钠（均为优级纯），购自上海上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。

1.1.2 仪器与设备

味觉传感系统（SA204B，日本Insent公司）；电子鼻（PEN3，德国AIRSENSE公司）；分析天平（FA324TC，上海力辰邦西仪器有限公司）；恒温水浴锅（HH-2，天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030，上海一恒科学仪器有限公司）；恒温气浴震荡器（THZ-72S5，常州市国旺仪器制造有限公司）；高效液相色谱仪（LC-2010A，日本岛津）；气相色谱质谱联用仪（7890B-5977B，美国安捷伦公司）；萃取头（50/30 μm DVB/CAR on PDMS，西格玛奥德里奇公司）；顶空固相微萃取（HS-SPME，西格玛奥德里奇公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 酱油嗅觉成分的测定

电子鼻参数设置以及试验方法参考范霞等[19]的方法，略作修改。准确吸取3 g样品于容量40 mL的顶空瓶中后静置，30 min后进行检测。样品准备时间与自动调零时间均设置为5 s，样品测定检测1 s，测定时长120 s，清洗时间150 s，内部空气流速300 mL/min，进样流量300 mL/min。选取115～118 s检测数据进行分析。

不同传感器对应的化合物类型见表2。

表2 电子鼻不同传感器对应物质种类

1.2.2 酱油挥发性成分的测定

参考Wang等[20]的方法对6组酱油的挥发性成分进行测定。

使用配备DB-wax毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进行GC-MS分析。GC-MS分析的进样为不分流进样，进样时间0.5 min。使用超纯氦气作为载气进行分析，流量1 mL/min，柱流量1.50 mL/min，柱温保持在40 ℃等温5 min，以5 ℃/min升温至220 ℃，保持2.5 min。离子源和接口温度分别保持在230 ℃和260℃。质谱仪在全扫描模式下运行，并记录m/z20～400范围内的质谱。

试验对检测结果根据相似度、保留指数与峰面积进行定性及计算相对含量；将检测得到的数据进行整理，根据沈嘉森等[21]的方法运用峰面积归一法进行计算，求得各积分色谱峰占总峰面积百分比，进而测得不同发酵容器发酵酱油各组分相对含量。

1.2.3 酱油的体外降血压活性

1.2.3.1 HPLC分析的样品准备[21-23]

HPLC分析的总反应体积为800 μL，包括250 μL 6.5 mmol/L的HHL，50 μL 60 mU/mL的ACE酶及75 μL样品溶液。

pH 8.2硼酸盐缓冲溶液的配制：0.05 mol/L硼砂缓冲溶液（3.8114 g硼砂+200 mL超纯水），0.2 mol/L硼酸缓冲溶液（6.184 g硼酸+500 mL超纯水）。将140 mL 0.05 mol/L硼砂缓冲溶液与260 mL 0.2 mol/L硼酸缓冲溶液混合在一起。pH 8.2硼酸盐缓冲溶液的配制（含NaCl）：在每100 mL pH 8.2的硼酸盐缓冲溶液种添加0.351 g氯化钠。

HHL：0.025 g HHL+9.929 mL pH 8.2的硼酸盐缓冲溶液配制成6.5 mmol/L的HHL溶液。

ACE酶：0.1 U的ACE酶+1.67 mL硼酸盐缓冲溶液配制成60 mU/mL的ACE酶溶液。

HA标准溶液：取适量马尿酸对照品，用pH 8.2的硼酸盐缓冲液配制成1 mmol/L的马尿酸对照品储备溶液，用pH 8.2的硼酸盐缓冲液稀释成不同浓度的马尿酸标准溶液，备用。

样品溶液：准确吸取1 g酱油试样定容到100 mL容量瓶内，配制成质量浓度10 mg/mL的酱油溶液，用pH 8.2的硼酸盐缓冲溶液逐级稀释成质量浓度为2，4，6，8和10 mg/mL，备用。

取1.5 mL离心管备用，将ACE与样品溶液分别移取50 μL和75 μL混合，在37 ℃保温10 min后加入250 μL HHL溶液。恒温振荡器中在37 ℃与300 r/min条件下振荡30 min，加入425 μL 1.0 mol/L的盐酸溶液终止反应后过0.45 μm滤膜备用。同时用75 μL pH 8.2的硼酸盐缓冲溶液代替酱油样品溶液作为空白对照组进行分析。通过式（1）计算ACE抑制活性（%）。

ACE抑制率=（A-B）/A×100% （1）式中：A为空白组马尿酸的峰面积；B为样品中的马尿酸峰面积。

1.2.3.2 HPLC分析条件

液相色谱条件：C18色谱柱，150 mm×4.6 mm，粒径5 μm；按照洗脱梯度运行时间25 min；流速0.5 mL/min；柱温25 ℃；检测波长228 nm；进样量10 μL。

洗脱条件及流动相：流动相A为水（超纯水-三乙胺=99.9+0.01）；流动相B为乙腈（乙腈-三氟乙酸99.95+0.05）。程序设置如表3所示。

表3 HPLC梯度洗脱程序

1.3 数据处理

数据使用SPSS软件进行分析，利用Excel进行计算绘图分析，所得数据用平均值±标准差表示，采用皮尔逊检验法进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 酱油嗅觉成分的分析

6组供试酱油的PCA分析结果见图1。在相关性矩阵模式下，第1主成分区分贡献率为96.724%。除S2与S6外，其余4组均可被电子鼻显著区分。这说明试样之间具有各自的特性，使得酱油试样具有各自不同的香气特色，并且电子鼻可根据这些酱油试样之间的不同香气特点将其区分开来。

图1 6组酱油电子鼻PCA图

通过Loadings分析PCA在相关性矩阵模式图中6号传感器W1S对第1主成分区分贡献率最大，8号传感器W2W对第2主成分区分贡献率最大。由图1可知，6组样品在PC2轴的距离很近，差异不大，而在PC1轴上的距离较远，在PC1轴上距离由远及近依次是S5、S3、S6、S2、S4、S1。说明样品的主要嗅觉成分差异体现在第1主成分上。

由电子鼻采集6组酱油115 s时10个传感器的电阻比值如表4所示，可以看出不同酱油10个传感器的电阻比值不一致。6组酱油试样的2，6，7和8号传感器G/G0值相对其他传感器电阻比值高，说明6组酱油中挥发物中含氮氧化合物、甲基类化合物、无机硫化物、醇醛酮类化合物相比其他化合物含量较高。分析表明，醇类及甲基类化合物是鉴别酱油品质的重要物质。

表4 6组酱油10个传感器电阻比值（G0为空气电阻值）

2.2 酱油中挥发性风味物质种类和含量的分析

由表5可知，S1、S2、S3、S4、S5和S6共6组酱油分别检测出72，69，59，75，55和49种挥发性风味物质，S1的酯类化合物与醛类化合物的种类均高于其他5种酱油试样，说明由木桶发酵酱油产生的酯类与醛类物质的种类较玻璃纤维发酵酱油在香气上更加复杂多样。

表5 6组酱油挥发性物质种类

由表6可知，6组酱油中共检测出130种挥发性风味物质，包括26种酯类化合物、18种醇类化合物、8种酸类化合物、11种醛类化合物、15种酮类化合物、12种酚类化合物、烃13种类物质、13种吡嗪类物质和14种其他类物质。

表6 6组酱油的挥发性风味物质

如图2所示：醇类物质在6组酱油试样中的占比均最大，S1、S2、S3、S4、S5和S6中醇类物质所占的比例分别为52.1%，64.5%，65.64%，63.72%，67.65%和71.58%；酯类物质所占的比例分别为13.57%，4.8%，7.3%，11.87%，7.84%和7.25%；酸类物质所占的比例分别为4.64%，5.03%，4.15%，2.79%，4.35%和0.11%；醛类物质所占的比例分别为12.44%，11.39%，9.91%，10.77%，11.25%和13.3%；酮类物质所占的比例分别为1.45%，0.15%，0.23%，0.86%，0.19%和0.76%；酚类物质所占的比例分别为3.57%，4.12%，4.42%，4.53%，3.63%和1.91%；烃类物质所占的比例分别为0.57%，4.16%，4.24%，0.09%，0.22%和0.03%；吡嗪类物质所占的比例分别为5.82%，2.69%，1.27%，2.86%，2.47%和2.1%；其他类物质比例分别为6.24%，3.13%，2.16%，2.65%，1.95%和2.92%。

图2 6组酱油中挥发性风味物质比例图

酱油中所含的醇类、酯类、醛类、酸类和酮类等是酱油香气的重要组成部分。由表5和图2可知，6组供试酱油所检测出的挥发性风味物质中醇类化合物的含量均为最高，说明醇类化合物是决定酱油风味的重要化合物。6组酱油试样中S1的酯类物质、醛类物质、酮类物质、吡嗪类物质及其他类物质的相对含量均高于其他5组酱油试样。

酱油挥发性成分中含量最多的是醇类，这些醇类物质的主要来源是来自酱油原料的成分当中的，其次在酱油发酵的过程中也会形成这些物质，在酱油发酵过程中所生成的低级醇主要是以乙醇为主，乙醇也是在发酵过程中酵母菌和乳酸菌的代谢产物[24]，除乙醇这种低级醇外，还会生成一些高级醇类，有研究表明，高级醇是通过艾利希途径从氨基酸中衍生而来的[25]。

酯类物质共26种，主要以乳酸乙酯和乙酸乙酯居多，酱油在发酵过程中会从原料大豆内生成一些高级脂肪酸，都对酱油的芳香气味有正向影响，S1中的酯类物质较其他5组试样种类多，相对百分含量也多，有研究指出，温度及水解会导致酯类物质的损失[26]，这也说明木桶在温度的控制上发挥了作用，能够产生更多的酯类化合物。

在酚类中，在所有测试样品中检测到4-乙基-2-甲氧基苯酚与2,4-二叔丁基苯酚，在S2与S5中检测出4-乙烯基-2-甲氧基苯酚，有研究已确定4-乙基-2-甲氧基苯酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚是影响酱油香气的重要香气成分[27]。Meng等[28]报道酚类物质在掩盖红酒和酱油果香方面的负面影响，因此可以表明4-乙基-2-甲氧基苯酚在影响酱油的最终质量方面发挥作用。

吡嗪被认为是重要的特征香气化合物，具有浓厚的酱香味主要与烘烤和坚果香气，Feng等[27]指出吡嗪没有贡献，因为它们的气味阈值高。在测试样品中鉴定出13种吡嗪，除2,6-二甲基吡嗪对酱油品质无明显影响外，检出的吡嗪类化合物含量对酱油品质有显着负向影响。在抑制葡萄酒的果香方面也观察到这种负面影响[26]。这表明这些吡嗪类化合物可能被认为是酱油中的重要香气缺陷。

醛类物质有11种。其中2-甲基丁醛主要是通过艾利希途径降解例如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸而产生的[29]，并且已被确定为对麦芽气味有很大影响。表6中显示酱油S1中2-甲基丁醛相对含量最高，这种成分对酱油的整体香气做出显着且积极的贡献[30]。

在酱油中的酸类中乙酸在测试样品中占主导地位，乳酸菌在发酵过程中产生的乙酸使酱油散发出酸味，并大幅增加酱油的香气。有研究表明[31]，乙酸可与醇反应生成相应的乙酸酯，从而赋予各种果香。因此，有理由认为酸对酱油的整体香气具有积极作用。

6组酱油试样共检测出的15种酮类化合物，木桶发酵酱油S1的酮类化合物的相对含量最高（1.45%），酱油中的酮可以产生甜味，并促进形成令人愉悦的香气，如青草味、果味和焦糖味[32]。酮类化合物对酱油最终质量的不同影响有明显的区别，这证实它们在酱油芳香成分中的作用是显着的，能够对酱油的最终品质产生积极影响。也可以间接证明木桶发酵对酱油发酵过程中的酮类物质的产生有一定正面作用。多项试验证实[33-35]，酱油的香气受原料、发酵时间和发酵容器的影响显著。

2.3 酱油的体外降血压活性的分析

6组酱油试样对ACE抑制率如图3所示。6组酱油对ACE酶均有一定抑制作用，6组酱油试样的ACE抑制率随着样品浓度增加而逐渐增大，呈正相关趋势；酱油质量浓度10 mg/mL时，试样S1的抑制率显著高于其余5组，达51.1%。

图3 6组酱油对ACE酶的抑制率

经过计算得出6组供试酱油的IC50值及IC值如表7所示，6组酱油试样都有一定的ACE酶活性抑制作用。但S1对ACE酶的抑制效果更加突出。因此可以说明木桶发酵酱油在一定程度上已被证明通过抑制ACE酶的活性和增强其抑制作用而具有一定保健功能。

表7 6组酱油抑制ACE酶的IC50值

根据五明纪春等[36]的研究，在酱油长时间的发酵过程中，由于原料中的蛋白水解物与还原糖之间产生美拉德反应，进而会产生一些类黑精。这些因美拉德反应所产生的黑色物质含有氨基侧链，这可能对ACE有抑制效果。ACE是血压调节有关的酶，据研究表明[37]，测定类黑精抑制血管紧张素转化酶活性的作用是在体外环境下所得到的结果。木桶发酵酱油在反应液的质量浓度为10 mg/mL时，也能抑制51.1%的ACE的活性。然而，ACE作为一种分布在动脉血管壁细胞中的酶，类黑精是否能在人体内到达其作用部位是未来研究的课题。

3 结论

酱油中含有较多的挥发性风味物质，利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）检测6组样品，共检测出130种香气化合物，包括26种酯类物质、18种醇类物质、8种酸类物质、11种醛类物质、15种酮类物质、12种酚类物质、13种烃类物质、吡13种嗪类物质及14种其他化合物。同时采用峰面积归一化法计算出木桶发酵酱油S1中酯类、酮类和吡嗪类化合物的相对含量为6组试样中最高（分别为13.27%，1.45%和5.82%）。6组酱油样品的主体风味成分的组成及贡献程度不同。乙酸乙酯、苯甲醛、2,3,5-三甲基吡嗪等这化合物都能对酱油香气的形成起到至关重要的作用，但是它们的贡献程度却不同。除此之外，愈创木酚、4-乙基-愈创木酚等酚类物质也能对不同酱油样品赋予不同香气与味道。在体外降血压的研究中，6组供试酱油对ACE酶都有一定抑制作用，但在测定浓度范围内，木桶发酵酱油S1对ACE的抑制效果显著高于其他5组，IC50值为10.23 mg/mL。