桂西地区农产品中农药残留降解方法的分析及建立

朱峻逸，杨水平

1.百色市食品药品检验所（百色 533000）；2.百色市森林保护检疫站（百色 533000）

农药在改善人类生活方面起到重要作用。但是，现今农药的滥用现象也愈发严重，我国是农药使用大国，农药防治面积也居世界前列[1]。我国农药的使用结构不合理，主要体现在杀虫剂、有机磷杀虫剂以及甲胺磷等高毒有机磷杀虫剂的各自占比均高于70%[2]，加上监管不力等多种原因，农药残留对人体健康造成很大威胁[3-6]。

农药在自然环境中完全降解需要时间很长，有些农药甚至根本不能自然降解[7]，农药会在身体中沉积，不仅给人体健康带来潜在威胁，还会诱发心脑血管病等一系列慢性病症，这些都与农药残留有关系，甚至还会传给下一代，危及子孙后代的身体健康[8-11]。

现有农药残留降解的方法存在效率低、易引起产品营养损失等缺点，并且对品质造成影响[12-18]。桂西地区由于当地的气候和地理特征的特殊性，农产品和农药的使用也与其他地方有一定的差异性，因此，亟须对桂西地区的食用农产品中农药的降解方法进行总体研究，同时对降解效果做出客观评价，给社会及百姓提出最高效、最便捷且用时最短的降解方法。

高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）作为近几年兴起的分析检测技术，因其具有分析范围广等优势，被广泛应用于化学和测绘科学技术等领域复杂有机混合物的各种检测中[19-21]。桂西地区食用农产品和环境中的农药残留情况尚未有较为有效的降解方法，而且对于使用高效液相色谱-质谱联用法（HPLCMS）检测桂西地区食用农产品中农药残留的方法还需要进行相应优化，这种优化处理的方法在国内尚数首例。因此，试验向15类食用农产品中加入11种不同浓度农药，利用不同物理、化学、微生物等方法进行降解处理，采用高效液相色谱-质谱联用法（HPLCMS）检测其中农药残留并进行相应研究讨论，分析筛选出最高效、最便捷且用时最短的农药残留降解方法，为更好降解农药残留提供相关科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent Technologies 6460高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS，美国Agilent公司）；XS205DU型分析电子天平（美国Mettler Toledo公司）；TXB622L型电子天平（株式会社岛津制作所）；ST4R PLUS型冷冻高速离心机（美国ThermoFisher Scientific公司；PN545-10000-00-2型涡旋混合器（德国海多尔夫公司）；SK8200HP型超声机（上海科导超声仪器有限公司）；超纯水机（明澈Dirext-Q3，艾威仪器科技有限公司）；JP39V-1300型组织捣碎机（浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司）；SHA-B型水浴恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；HW-I型红外线灭菌器（山东博科科学仪器有限公司）；BK-UVC-30A型紫外线杀菌灯（山东博科科学仪器有限公司）。

敌敌畏、苯醚甲环唑、酰烯吗啉、腈苯唑、氯吡脲、水胺硫磷、甲基异柳磷、甲霜灵、甲胺磷、多菌灵、辛硫磷标准品（质量浓度均为100 μg/mL）；无水硫酸镁（≥98.0%）；氯化钠（≥99.5%）；无水碳酸钠（≥99.8%）；碳酸氢钠（≥99.8%）；高锰酸钾（≥99.5%）；柠檬酸钠，二水合物（≥99.0%）；柠檬酸二钠盐倍半水合物（≥99%）；甲酸（色谱纯，≥98.0%）；乙腈（色谱纯，≥99.95%）；双氧水（优级纯，≥30%）；盐酸（优级纯，10 mol/L）；氢氧化钠（≥96%）；硫酸铁（≥99%）。

枯草芽孢杆菌（≥4.0亿/g活菌）；细黄链霉菌（≥2.0亿/g活菌）；哈慈木霉菌淡紫孢菌（≥5.0亿/g活菌）。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）固相萃取小柱（批号：M00076）；石墨化炭黑（GCB）固相萃取小柱（批号S196086001）；微孔滤膜（有机相，13 mm×0.22 μm）。

1.2 标准品溶液和空白溶液的制备

敌敌畏、苯醚甲环唑、酰烯吗啉、腈苯唑、氯吡脲、水胺硫磷、甲基异柳磷、甲霜灵、甲胺磷、多菌灵、辛硫磷标准溶液（1 μg/mL）制备：精准吸取1 mL的100 μg/mL标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

空白溶液制备：乙腈作为空白溶液。

1.3 材料及其制备

15类食用农产品。其中，豆芽选用黄豆芽，鳞茎类蔬菜选用韭菜，鲜食用菌选用金针菇；芸薹属类蔬菜选用结球甘蓝，叶菜类蔬菜选用大白菜，茄果类蔬菜选用茄子，瓜类蔬菜选用黄瓜，根茎类蔬菜选用胡萝卜，薯芋类蔬菜选用马铃薯，水生类蔬菜选用莲藕，豆类蔬菜选用菜豆，仁果类水果选用苹果，核果类水果选用桃，柑橘类水果选用橙，浆果和其他小型水果选用葡萄。果蔬购于桂西地区各地不同的农贸市场和超市，食用菌、水生蔬菜、茎菜类蔬菜、豆类蔬菜、核果类水果、瓜类蔬菜及其他蔬菜和水果取样量及处理方法均参考GB 23200.121—2021《食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱联用法》[22]中6.1中试样制备的相关内容，制备后充分混匀，用四分法取一部分样品或全部用组织捣碎机匀浆后，转入聚乙烯瓶中备用。

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备

使用天平称取10 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈及1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1 min，加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠二水合物、0.5 g柠檬酸二钠盐倍半水合物，剧烈振荡1 min后按4200 r/min离心5 min。定量吸取上清液，用PSA固相萃取小柱净化，加入150 mg无水硫酸镁后再用GCB固相萃取小柱净化，净化后的液体装入50 mL离心管中，涡旋混匀1 min，按4200 r/min离心5 min，吸取上清液过微孔滤膜后直接在HPLC-MS上进样分析检测。同时采用相同的方法处理空白溶液制备成为样品空白。

1.4.2 加标样品制备

使用天平分别称取15类食用农产品，每类均称取10 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，分别加入0.2，0.4和0.8 mL敌敌畏、苯醚甲环唑、酰烯吗啉、腈苯唑、氯吡脲、水胺硫磷、甲基异柳磷、甲霜灵、甲胺磷、多菌灵、辛硫磷标准溶液，加入10 mL乙腈及1颗陶瓷均质子后，剧烈振荡1 min，备用。

1.4.2.1 加标样品进行化学降解处理

在每类加标处理后的样品中分别加入1 mL氢氧化钠溶液（2 mol/L）、1 mL盐酸溶液（2 mol/L）、1 mL双氧水（30%）、1 mL氯化钠溶液（2 mol/L）、2 g碳酸氢钠、2 g碳酸钠、2 g高锰酸钾、2 g硫酸铁，剧烈振荡1 min，静置1 d后，参照1.4.1的后续处理方法进行。

1.4.2.2 加标样品进行物理降解处理

将每类加标处理后的样品分别放入超声机，超声6 h，放入阳光下照射8 h，放入紫外光下照射8 h，放入红外光下照射8 h，放入恒温水浴振荡器中，在80℃的水加热8 h，剧烈振荡1 min，静置1 d后，继续参照1.4.1的后续处理方法进行。

1.4.2.3 加标样品进行微生物降解处理

在每类加标处理后的样品中分别加入5 g枯草芽孢杆菌、5 g细黄链霉菌和5 g哈慈木霉菌淡紫孢菌，剧烈振荡1 min，放入28±2 ℃培养箱培养48 h后，继续参照1.4.1的后续处理方法进行。

1.4.3 液相色谱条件

色谱柱（Agilent，C18，2.1 mm（内径）×100 mm，粒径1.8 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL；流动相梯度条件见表1。

1.4.4 质谱条件

离子源类型为电喷雾离子源；扫描方式为正离子（electrosprayionization，ESI+）全扫描模式；电喷雾电压为正离子4000 V；离子源温度320 ℃；雾化气32 psi；辅助加热器15 psi；雾化气流速10 L/min；辅助加热气流速3 L/min；辅助加热气温度300 ℃；碰撞气为高纯氮；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）：每种农药分别选择2个子离子。所有检测的子离子按照出峰顺序，分时段分别检测。不同农药选择的反应监测母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量见表2。

表2 11种农药的MRM质谱采集参数

精确吸取标准溶液，用空白溶液将标准溶液稀释成质量浓度为0.005，0.010，0.020，0.050，0.100和0.200 mg/L的标准工作溶液，在上述高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）工作参数条件下，依次使用该方法对标准工作溶液、样品空白溶液、样品处理后溶液、加标样品处理后溶液、加标样品进行降解处理后的溶液分别进行测定，由HPLC-MS工作站软件分析相关数据，仪器会自动绘制各个农药的标准曲线，并且计算出样品、加标样品及加标降解后样品中各个相对应的农药含量。

2 结果与分析

2.1 前处理优化

2.1.1 提取净化方式的优化

通过比对发现，普通高速离心会产生高温从而影响农药含量，而采用低温高速离心提取的方法，能有效避免这种情况，因此，选择采用低温高速离心的方法提取样品。另外，发现自行购买乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶和石墨化炭黑进行净化容易带入杂质，而且由于每次使用量会有差异，这就造成试验结果的不稳定，相反成品的固相萃取小柱则能很好地避免这些问题，让结果更加可靠，同时也更加方便快捷。通过购买多家生产的固相萃取小柱进行试验，根据试验结果的稳定性、净化效果、杂质带入情况、净化效率等多方面因素的比较，最终选择天津博纳艾杰尔科技有限公司生产的乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）固相萃取小柱和广州沃恩生物科技有限公司生产的石墨化炭黑（GCB）固相萃取小柱进行样品的净化。

2.1.2 试验条件的优化

2.1.2.1 色谱条件的优化

对流动相通过对比发现，在有机相中，乙腈作为流动相相比于甲醇分离农药更有优势，保留时间相对更短，分离效率更高，分离峰形更好，这说明在乙腈中农药的响应效率比在甲醇中更高。因此，有机相选择乙腈不仅响应更好，而且更节约时间。在水相中，一定比例的酸性水相有利于促进化合物的分离，因此，对不同浓度甲酸水溶液、甲酸铵水溶液及其甲酸铵-甲酸水溶液的分离情况进行考察，结果发现0.1%甲酸水的水相和乙腈的有机相作为流动相时，分离农药效果最好，化合物能明显分开且峰形较好，分离效率较高，保留时间相对较短，且分离度均能达到要求。综上所述，选择0.1%甲酸水和乙腈作为流动相。

2.1.2.2 质谱条件的优化

用1.2的标准溶液，上机测试，同时参考GB 23200.121—2021《食品安全国家标准 植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》[22]中质谱参数，11种农药均采用电喷雾离子源的类型，进行正离子（electrosprayionization，ESI+）全扫描模式，根据11种农药的化学结构及其特性，采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）的检测模式，在保证检测灵敏度、定量准确性、信号响应值，结合不同去簇电压和碰撞气能量下，不同农药的正离子全扫描模式质谱图，同时利用软件自动调谐优化功能，确定质谱相关参数见表2。

2.2 线性关系考察

HPLC-MS的动态线性范围较宽，能够达到7个数量级。试验中在优化后的仪器条件下采集一系列待测农药标准溶液，由仪器自动绘制出标准曲线并给出线性关系。从结果中可以看出11种农药的标准曲线线性关系良好，相关系数r均≥0.996，见表3。

表3 标准曲线方程、相关系数、线性范围、定量限与信号噪声比

表4 加样回收率及相对标准偏差（n=6）

2.3 定量限、线性关系、回收率和精度度的考察

使用移液枪分别精密量取0.1 mL标准溶液（1 μg/mL）加入1.4.1的空白对照溶液中，按1.4.3和1.4.4的条件进行样品测定，以其信号噪音比是否大于10来判定能否作为定量限，方程中Y代表含量，X代表样品量，结果见表3。

2.4 精密度

使用移液枪量取1.4.4配制的质量浓度5 μg/L的标准品溶液，连续进样测定6次，计算出11种农药6次测得的质量浓度的SRSD。结果显示，11种农药相对强度的SRSD分别在0.61%～4.26%（n=6）之间，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性

首先使用移液枪精密吸取待测样品（白菜）溶液，分别于0，2，4，8，12和24 h后进样测定计算各种农药6次质量浓度的SRSD分别在0.57%～3.95%（n=6）之间，表明待测样品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.6 重复性

使用分析天平精密称取食用农产品样品（白菜），共6份并分别做好标记，按1.4.1的方法制备供试品溶液，进样测定计算6份样品中含有的11种农药，11种农药质量浓度的SRSD分别在0.71%～3.85%（n=6）之间，表明试验方法重复性好。

2.7 加样回收率

使用按照1.4.2方法制备的加标样品（白菜），共6份，同法制备试剂空白溶液，测定各个农药含量，计算回收率，平均加样回收率为95.45%～100.19%，表明该测定方法准确度良好，符合农药测定要求。其中，加标量0.8 mL的加标样品的结果见表2。

2.8 样品加标降解后测定结果

分别用天平称取约10 g 15类食用农产品，每类36份，每2份作为1组平行样品，其中2份作为空白样品对照，另外34份按照1.4.2的方法制备成加标溶液，将2份样品作为加标样品对照，另外32份样品按照1.4.2.1、1.4.2.2和1.4.2.3的方法降解，分别测定多菌灵等11种农药的含量。检测结果已通过系统将空白样品中的农药含量扣除，所以，默认空白样品中不含有农药残留。15类食用农产品加标后就用不同方法进行降解，结果显示，15类农产品中农药平均被降解率分别为超声降解（10.52%～10.92%），阳光照射降解（0.23%～0.61%），紫外光照射降解（0.52%～0.82%），红外光照射降解（0.51%～0.70%），水浴加热降解（0.39%～0.58%），氢氧化钠降解（86.39%～89.48%），盐酸降解（58.85%～62.64%），双氧水降解（72.64%～76.17%），氯化钠降解（0.08%～0.39%），碳酸氢钠降解（58.68%～62.54%），碳酸钠降解（34.41%～38.91%），高锰酸钾降解（69.37%～73.05%），硫酸铁降解（38.64%～42.87%），枯草芽孢杆菌降解（22.46%～26.31%），细黄链霉菌降解（31.13%～35.48%），哈慈木霉菌淡紫孢菌降解（22.12%～25.58%）。其中，茄子加标后被降解的相关参数见表5。

表5 茄子中农药被降解后的含量测定结果及农药被降解率（n=18）

X0～X17分别为空白样品、加标样品、加标后超声降解样品、加标后阳光降解样品、加标后紫外光降解样品、加标后红外光降解样品、加标后水浴加热降解样品、加标后氢氧化钠（2 mol/L）降解样品、加标后盐酸（2 mol/L）降解样品、加标后双氧水（30%）降解样品、加标后氯化钠（2 mol/L）降解样品、加标后碳酸氢钠降解样品、加标后碳酸钠降解样品、加标后高锰酸钾降解样品、加标后硫酸铁降解样品、加标后枯草芽孢杆菌降解样品、加标后细黄链霉菌降解样品、加标后哈慈木霉菌淡紫孢菌降解样品。

3 讨论

采用高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）的检测手段，在样品前处理中采用低温高速离心的方法提取样品，有效解决普通高速离心产生高温影响农药含量的问题。另外，使用通过对比筛选好的成品固相萃取小柱来进行样品净化处理，有效降低自行填充净化带来的不稳定性及杂质的带入，更好地保证检测结果的稳定性。在仪器条件的优化中，通过对比、观察、测试，选择0.1%甲酸水-乙腈作为流动相，以及相应的色谱和质谱的参数条件，作为试验的最优方法条件。相比于GB 23200.121—2021《食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱联用法》，试验进行的优化条件更有利于快速准确地检测出相应的结果，也很好地避免相关的试验干扰因素，使得结果根据准确可靠。

试验采用固相萃取+高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）检测农药，几乎克服以往液相和气相等分析方法的大多数缺点，不仅操作简便，测定范围广，还可同时分析多种物质，且有速度快、灵敏性高、稳定性好、准确性高等特点，已在土壤、水源、农作物、食品、药品、保健食品、化妆品及其相关产品的中农药残留控制、农药分析及质量标准的制定等多方面进行广泛应用[23-26]。试验在15类食用农产品中加入敌敌畏、苯醚甲环唑、酰烯吗啉、腈苯唑、氯吡脲、水胺硫磷、甲基异柳磷、甲霜灵、甲胺磷、多菌灵、辛硫磷11种标准溶液，使用物理降解方法（超声、阳光照射、紫外光照射、红外光照射、水浴加热）、化学降解方法（氢氧化钠、盐酸、双氧水、氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、高锰酸钾、硫酸铁）和生物降解方法（枯草芽孢杆菌，细黄链霉菌，哈慈木霉菌淡紫孢菌）对已加入标准溶液的食用农产品进行降解处理，采用固相萃取+高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）等检测手段监测降解效果，通过最终的检测数据可以看出，降解效果从优到差依次为氢氧化钠＞双氧水和高锰酸钾＞盐酸和碳酸氢钠＞碳酸钠、硫酸铁、细黄链霉菌＞枯草芽孢杆菌、哈慈木霉菌淡紫孢菌＞超声，阳光照射、紫外光照射、红外光照射、水浴加热、氯化钠的降解效果几乎没有。由此可见，可将试验结论运用到日常生活和环境的农药残留的降解中，减少农药残留对人体和环境的危害。另外，也可将优化的固相萃取+高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）的条件运用于其他领域的农药检测，充分发挥HPLC-MS在检测中的优势。

4 结论

通过试验和讨论内容可以得知，6类降解农药残留的方法在降解效果上有优劣之分，且在环境二次污染上又各有区别。所以，在日常生活和环境治理中，这6类降解农药残留的方法可以搭配使用，如物理方法搭配化学方法，物理方法搭配微生物方法，一种化学方法搭配另一种化学方法，一种微生物方法搭配另一种微生物等，这样降解的效果就会更好，甚至达到事半功倍的效果。另外，在使用上述降解方法的时候，还应该考虑到环境因素，尽量选择不会造成环境污染的方法。

试验对农药检测方法的前处理和仪器条件进行优化，结果显示：被测的11种农药的线性关系良好，其线性范围均为5～200 μg/L（r均≥0.996），定量限为0.01 mg/kg，信号噪声比均大于10，精密度、稳定性、重复性试验的SRSD≤4.26%，加标回收率为95.45%～100.19%（SRSD为0.52%～3.92%，n=6）。通过方法学考察结果显示，高效液相色谱—质谱联用法（HPLC-MS）操作简单方便、效率高、分析速度快、灵敏度高，同时测定结果的精密度以及准确性较好。该法适合于桂西地区食用农产品中农药残留的测定，也可用于其他领域农药残留的检测。通过测定结果，得到6类能有效降解桂西地区食用农产品中农药残留的降解方法，同时，这6类降解方法也可运用于日常生活和环境治理中，为保障人民身体健康发挥重要作用，但农药残留降解相关研究尚显不足，有必要进行进一步探索和研究。