超高相液相色谱串联质谱法分析鸡蛋中金刚乙胺含量残留

林柯璐 ，王玲，舒畅 ，潘志明

1.德阳市食品药品安全检验检测中心（德阳 618000）；2.德阳市食品检验重点实验室（德阳 618000）；3.德阳市罗江区粮食质量安全监督检查站（罗江 618500）

金刚乙胺是最早用于治疗流感的人用抗病毒类药物[1]，曾被广泛应用于家禽养殖[2]。移植兽用缺乏科学规范、安全有效试验数据。人类食用金刚乙胺超标的蛋类，对孕妇、哺乳期妇女、老年人可能会造成不良反应。为此，国家明确禁止在动物养殖过程中使用金刚乙胺。然而，由于金刚乙胺合成路线简单、成本低廉，其在畜禽养殖中被违法投喂现象仍时有发生。由此可见，对于鸡蛋中金刚乙胺残留含量的检测具有重要现实意义。

我国对于鸡蛋中金刚乙胺残留含量的检测方法多采用高效液相色谱法及液相色谱-串联质谱法[3-11]。高效液相色谱法抗干扰能力差，易受基质效应影响，且容易出现假阳性而液相色谱-串联质谱法具有高效分离和多组分定性、定量的优点，因此成为近年兽药残留检测方法研究的主要方法[12]，常用的标准有SN/T 4253—2015《出口动物组织中抗病毒类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》[13]和农业农村部483号公告-6-2016[14]。试验从提取液、净化方式等方面优化鸡蛋样品前处理方法，结合UPLC-MS/MS，采用内标法建立鸡蛋中金刚乙胺残留检出方法，为禽蛋产品的质量安全监管提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290-6460液质联用仪（美国安捷伦科技公司）；MS205DU电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；MTN-5800A氮吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；VG3 S025涡旋振荡器（德国IKA公司产品）；TGL-16A台式高速冷冻离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）。

金刚乙胺、美金刚-d6标准品（坛墨质检，100 μg/mL）；乙腈、甲醇、正己烷（色谱纯，德国默克公司）；甲酸（优级纯，成都科隆化学品有限公司）；乙酸铵（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯乙酸（分析纯，北京化工厂）；固相萃取小柱（美国安捷伦科技公司）；尼龙微孔滤膜（天津津腾公司实验设备有限公司）；实验室用水为超纯水。生鲜鸡蛋购于超市和农贸市场。

1.2 标准溶液配制

配制金刚乙胺标准中间溶液（100 ng/mL）：精密量取100.0 μL金刚乙胺标准溶液，置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，于-18 ℃避光保存。

配制美金刚-D6内标工作溶液（100 ng/mL）：精密量取100.0 μL美金刚-D6标准溶液，置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，于-18 ℃避光保存。

分别吸取0.1，0.2，0.5，1.0和2.0 mL标准中间液至10 mL容量瓶中，分别加入0.20 mL美金刚-D6内标工作液，用初始比例流动相稀释定容至刻度线，得到1，2，5，10和20 ng/mL的系列标准工作液。

1.3 样品前处理

1.3.1 采样和试样制备

取超市和农贸市场上购买的鸡蛋，采用四分法缩减取200 g，使用料理机进行粉碎均质，装入自封盒中，冷藏避光，备用。

1.3.2 提取

称取2 g（精确至0.01 g）均匀样品至50 mL离心管中，准确加入100 μL内标工作液，加入10 mL 1%乙酸-乙腈（V/V），涡旋30 s，超声振荡提取20 min，按8000 r/min离心5 min，上清液全部转移至50 mL离心管中；加入10 mL的1%乙酸-乙腈（V/V）重复提取1次，合并全部提取液，待净化。

1.3.3 净化

取上述全部乙腈层提取液加入已用5 mL甲醇和5 mL水活化的PCX柱中，分别用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，弃去全部流出液，用真空泵减压抽干，用6 mL 5%氨水甲醇洗脱并接收，于45 ℃氮吹浓缩后采用1 mL 0.1%甲酸水溶液-甲醇（10+90，V/V）定容。过0.22 μm滤膜后，供超高效液相色谱-串联质谱分析。

1.4 色谱条件

色谱柱采用Zorbax Eclipse Plus-C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为甲醇；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样体积2.0 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 洗脱条件

1.5 质谱条件

离子源，电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；多反应监测（MRM）；毛细管电压4.5 kV；雾化器压力40 psi；干燥气流速11 L/min；干燥气温度300 ℃；其他质谱条件见表2。

表2 金刚乙胺、美金刚-D6的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 不同提取溶液提取效果的比较

金刚乙胺含有极性氨基基团，易溶于极性有机溶剂，酸性条件更有利于其解离提取。鸡蛋富含蛋白质、磷脂等，采用乙腈作为提取溶剂有利于蛋白质的沉淀，降低基质干扰，三氯乙酸也有助于蛋白质变性沉淀。参考SN/T 4253—2015《出口动物组织中抗病毒类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》[13]、农业农村部2483号公告-6-2016[14]及文献[3,6-7,9,11]，试验通过空白样品加标（加标量10 μg/kg）方式，比较表3中8种不同提取液对目标化合物的提取回收率。结果表明，纯溶剂提取时回收率较差。向溶剂中加入酸可以提高回收率，而加入乙酸的效果优于甲酸。因此，选择1%乙酸乙腈作为萃取液。

表3 不同提取溶剂对金刚乙胺化合物的提取率

2.1.2 不同净化方式的选择

试验采用空白样品加标（加标量10 μg/kg）方式比较不同阳离子固相萃取柱对于目标物提取液的净化效果，其回收率如图1所示。研究发现，PCX柱回收效果最好，因此选择PCX柱为净化柱。

图1 不同固相萃取柱净化下金刚乙胺的提取回收率图

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 流动相的选择

试验对比乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-1%甲酸水、乙腈-1%甲酸水6种流动相体系对金刚乙胺10 ng/mL标准溶液的分离效果。单独采用甲醇-水、乙腈-水作为流动相，结果发现色谱响应一般，色谱峰形较宽[4]。由于金刚乙胺含有氨基，向流动相中加入适量酸能促进离子化效应并提高响应值[16]，因此在水相中加入适量的甲酸。对比0.1%甲酸水和1%甲酸水溶液，0.1%甲酸水溶液作为水相，峰型及峰宽更好。而有机相选择乙腈时的出峰时间比甲醇作为有机相的出峰时间快，较早出峰可能会有干扰[10]。因此采用体积分数0.1%甲酸溶液-甲醇作为流动相。在最佳试验条件下金刚乙胺的色谱图和特征离子色谱图如图2和图3所示。

图2 金刚乙胺色谱图

图3 金刚乙胺特征离子色谱图

2.2.2 柱温的选择

分别选择柱温25，30，35和40 ℃，考察金刚乙胺的出峰效果。结果表明，在其他条件不变时，改变柱温色谱峰响应与保留时间没有明显变化，但柱温较高时，流动相的溶解度增大，柱压明显降低。考虑到色谱柱使用寿命，采用柱温40 ℃，与葛晓晓等[3]得出结论一致。

2.3 基质效应

基质效应是液质检测过程中常常碰到的问题，目标化合物在雾化过程中由于基质成分复杂，受到干扰，易产生抑制或增强的效果，使得分析结果出现偏离。同位素内标法因其性质与目标物相似，受基质影响程度相同，是液质联用分析中常采用的降低基质效应、提高定量准确性的一种方法[13]。试验选择美金刚-D6作为金刚乙胺同位素内标物，经过内标校正后的金刚乙胺曲线方程因已知同位素内标物浓度而减少一定的基质效应。因此，该方法的标准工作曲线用溶剂直接配置。

2.4 线性范围、定量限及回收率和精密度

配制含量1，2，5，10和20 ng/mL的系列标准溶液。按照其所得峰面积的平均值与对应标准溶液的质量浓度作标准曲线。同时选用不同的空白鸡蛋，按照1.3小节进行添加回收试验，分别添加质量分数1，2和10 μg/kg这3个水平的标准品，平行测定6次，以10倍信噪比对应的浓度确定方法定量限，结果见表4。说明能取得良好的回收效果。

表4 金刚乙胺的的回归方程、相关系数及定量限

2.5 实际样品分析

为进一步验证试验方法的实用性，采用该方法对市场随机收集的40批次鸡蛋样品进行检测，结果均未检出。今后可通过扩大抽样量，对该方法进行充分验证。

3 结论

结合超高效液相色谱串联质谱为检测手段，建立一种测定鲜蛋中金刚乙胺的快速、简便、准确、成本低的检测方法。分别对提取溶剂、固相萃取柱、色谱条件做了优化研究，采用内标校正，定量限低，效果稳定，重现性好，能够满足精密度要求。对于实现鸡蛋金刚乙胺残留监控有着重要意义。