表面增强拉曼光谱法测定保健食品中非法添加物硝苯地平

皮江一，周陶鸿，林津，彭青枝

1.湖北省食品质量安全监督检验研究院（武汉 430075）；2.国家市场监管重点实验室（动物源性食品中重点化学危害物检测技术）（武汉 430075）；3.湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心（武汉 430075）

保健食品以其安全性高、不良反应小等特点而受消费者追捧。近些年，一些制假分子利用保健食品成分复杂、质量标准不完善及消费者对健康的心理需求，推出一大批具备“治疗”效果的保健食品，而这些保健食品存在夸大宣传疗效、售价高、成分不明确等问题[1-2]，如在降压类保健品中添加化学成分硝苯地平等药物[3-4]。患有冠心病、心绞痛的高血压患者在不知情条件下长期服用该类保健食品，并同时服用其他类降压药物，易引起头痛、心悸、窦性心动过速、血压骤然下降等不良反应，并可能伴随经常性的休克以至于出现心衰[5-6]。原国家食品药品监督管理总局办公厅在2016年发布《关于开展保健食品等三类食品非法添加非法声称问题专项治理工作的通知》中指出，抽样检验保健食品时重点检验降压类等药物。

检测以硝苯地平为主类药物（C17H18N2O6）的方法多为实验室检测，如薄层色谱法、高效液相色谱法（HPLC）及液质联用（HPLS-MS）[7-11]和红外光谱法[12-13]等，色谱法在检测灵敏度、选择性上有较强优势，但是色谱法检测好时较长，前处理方法较为复杂且需要有专业技能的人员，使得现场检测难以广泛展。表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman Spectroscopy，SERS）作为一种分子指纹光谱，具有灵敏度高、荧光背景低、样品处理简单、操作简便等优点[14-15]，且无需专业技能人员，表面增强拉曼通常以金或银的胶体或者附着以金或银的纳米粒子为基底，当分子受到合适频率的入照光照射激发下，会产生表面增强拉曼散射[16]。近些年，将SERS应用于食品安全、农药及非法添加，环境污染检测方面显示出巨大的应用潜力[17-18]，而如何制备出良好的拉曼信号增强基底成为研究热点。基于此，通过采用柠檬酸还原法制备胶体金溶液，制备出不同粒径和不同浓度的胶体金溶液[19-20]，以三聚氰胺为内标，建立一种基于SERS技术快速定量保健食品中非法添加硝苯地平等降血压类药物的方法，其中激光拉曼仪检测结果反应迅速，使得对未知物的筛查得以迅速开展[21-22]。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸三钠：国药集团化学试剂有限公司；硝苯地平、尼群地平、尼莫地平（中国药品生物制品研究所）。

集热式恒温加热磁力搅拌器（武汉科尔仪器设备有限公司）；显微共聚焦拉曼光谱仪（英国雷尼绍公司，inVia）；激光粒度仪（Mastersizer 3000E，Malvern有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 胶体金制备

一般采用还原氯金酸的方法制备胶体金，常用有白磷还原法、柠檬酸三钠还原法、枸杞酸三钠还原法。采用柠檬酸三钠还原法制备，根据配制不同比例及浓度的氯金酸和柠檬酸三钠溶液，可以制备出粒径范围在16～147 nm的不同浓度的胶体金粒子。

称取1.0 g氯金酸溶于100 mL超纯水中，即配制成浓度1%氯金酸溶液，取1.0 g柠檬酸三钠于100 mL超纯水中过0.22 μm滤膜，即柠檬酸三钠浓度1%。取250 mL圆底烧瓶，加入100 mL超纯水和1 mL 1%氯金酸溶液，开启磁力搅拌器，打开冷凝回流管，缓慢搅拌加热至微沸，迅速加入一定量0.40，0.50，0.70，1.00，1.50和2.00 mL）1%的柠檬酸三钠溶液，在搅拌过程中，会发现溶液由黄色向紫红、棕色转变，继续加热5 min后取下烧瓶冷却至室温，保存于棕色试剂，共得到6种不同粒径的纳米金胶。确定具备较强拉曼信号的胶体金制备配比后，取250 mL圆底烧瓶，加入100 mL超纯水和1 mL 1%氯金酸溶液，后续操作步骤同上，分别加入0.80 mL和0.90 mL柠檬酸三钠溶液，得到拉曼信号较强的2种粒径金胶。将1 mL氯金酸+0.90 mL柠檬酸三钠这组胶体金制备出4组（1.0 mL+0.9 mL，2.0 mL+1.8 mL，3.0 mL+2.7 mL和4.0 mL+3.6 mL）不同浓度的金胶溶液。

1.2.2 胶体金质量评价及粒径、浓度确定

通过目测法可以得到不同粒径的胶体金形成过程中的外观特征，采用紫外-可见光风光光度计在200～800 nm进行区段波长扫描，记录6种不同粒径金胶吸收波长曲线。使用粒度仪检测胶体金粒径范围，粒度仪需开机预热20 min，测量前样品应充分混匀，确保大小颗粒在体系中分散均匀。

1.2.3 拉曼光谱仪测定条件

曝光时间5 s，激光功率25 MW，扫描次数1次，物镜倍数50 L，激光波长785 nm，光栅1200 L/mm，扫描范围650～1700 cm-1。

1.2.4 三聚氰胺及硝苯地平的SERS检测

在测量瓶中依次加入500 μL纳米金溶胶、100 μL待测液、100 μL 1%的氯化钠溶液混匀后上机检测，每次需做平行检测。得到不同粒径及浓度的三聚氰胺和西地那非拉曼信号图，根据峰强确定增强因子最大的胶体金粒径及其浓度。其中，SERS增强因子的计算如式（1）。

式中：EF为增强因子；ISERS/CRaman为加入胶体金待测液的拉曼信号强度与该浓度下的比值，IRaman/CSERS为一定浓度待测液（不加胶体金）拉曼信号强度与该浓度下的比值。

1.2.5 标准曲线绘制

称取0.1 g（精确至0.0001 g）硝苯地平，用10 mL乙腈溶解，用水定容至100 mL，制备质量浓度1 mg/mL使用液，并将其稀释成质量浓度分别为10，20，40，60，80和100 μg/mL的标准系列中间液。分别取1 mL标准中间液与1 mL内标溶液三聚氰胺充分混匀，得到质量浓度10，20，40，60，80和100 μg/mL的标准系列工作液，按上述检测条件，混匀后上机检测。以硝苯地平浓度为横坐标，硝苯地平特征峰1334 cm-1与三聚氰胺特征峰707 cm-1的峰高比为纵坐标进行线性回归拟合，其中三聚氰胺内标质量分数设置50 mg/kg。

1.2.6 保健食品中辅助降血压类药物的SERS检测

实际样品检测：称取0.1 g（液体1 mL）捣碎样品于10 mL离心管中，向离心管中加入3 mL乙酸乙酯，涡旋萃取3 min后，离心分层，上层有机相为提取液。吸取0.5 mL提取液于2 mL离心管中，氮吹后加入乙腈，涡旋3 min，为待测液。依次向检测瓶中加入500 μL纳米金增强试剂、100 μL待测液和100 μL 1%的氯化钠溶液，混匀上机检测。

2 结果与分析

2.1 不同粒径胶体金外观判定及紫外光谱表征

6种不同加入量的柠檬酸三钠，加入量1.5和2.0 mL时，所得到的胶体金颜色呈葡萄酒红色，此时的胶体金粒径较小，视觉良好透明度高，无悬浮颗粒出现。当加入量1.0和0.7 mL时，胶体金呈现深红色。加入量0.4和0.5 mL时，呈砖红色。柠檬酸加入量0.40 mL时，胶体金透明度较低，肉眼可见明显颗粒悬浮出现，放置一段时间出现聚沉（图1）。

图1 不同粒径胶体金颜色

表1 胶体金制备-柠檬酸三钠法 单位：mL

对100 mL 0.01%氯金酸中不同添加量柠檬酸三钠（2.0，1.5，1.0，0.7，0.5和0.4 mL）制备的6种粒径胶体金进行200～800 nm波段扫描，得到扫描图谱（图2），均有明显吸收峰，随着还原剂柠檬酸三钠添加量减少，胶体金溶液最大吸收峰从520 nm移至550 nm。

图2 不同粒径胶体金紫外吸收光谱

2.2 三聚氰胺和硝苯地平拉曼光谱及其定性检测

拉曼光谱信号图号称指纹图谱，这意味着不同物质都有其相对应的特征拉曼光谱信号图，试验分别以三聚氰胺和硝苯地平、尼群地平、尼莫地平为测试物，采用的检测仪器为显微共聚焦拉曼光谱仪。由图3可以看出，三聚氰胺的特征峰为707 cm-1和1091 cm-1，降血压类药物硝苯地平、尼群地平、尼莫地平特征峰为1334 cm-1和1642 cm-1，根据该特征峰，可对保健食品中的硝苯地平进行定性判定，否则不能判定样品中是否含有硝苯地平，需进一步试验验证。

图3 三聚氰胺与硝苯地平表面增强拉曼光谱图

2.3 胶体金的粒径和浓度和对拉曼光谱响应的影响

2.3.1 金胶的粒径大小对拉曼信号响应的影响

试验以50 mg/kg三聚氰胺和硝苯地平标液为检测对象，加入不同含量柠檬酸三钠制备的胶体金，以三聚氰胺特征峰1091 cm-1和硝苯地平特征峰1334 cm-1处的峰值强度为绘制表。由表2可以看出，随着柠檬酸加入量的增加，峰值强度呈现先上升后下降趋势，柠檬酸三钠加入量分别为0.7，0.8，0.9和1.0 mL时，对应的拉曼峰强值由低到高，到峰值后由逐渐降低，由此表明拉曼信号强度与胶体金粒径相关，其拉曼峰强在柠檬酸三钠添加量0.9 mL时达到最高。

表2 三聚氰胺和硝苯地平检测数据表

通过粒径仪分析，在100 mL 0.01%氯金酸中添加0.9 mL 1%柠檬酸三钠时，由图4得知其制备的胶体金粒径在85.4 nm左右有较强信号，在8.8 nm处也出现部分信号强度。

图4 胶体金粒径分布及信号强度

2.3.2 金胶浓度大小对拉曼信号响应的影响

试验确定在100 mL纯水中加入1 mL 1%氯金酸溶液和0.9 mL 1%柠檬酸三钠溶液（1.0 mL+0.9 mL）可制备出拉曼增强效果较好的胶体金溶液。由表3可知，拉曼信号强度随着胶体金浓度的增加先上升而后平稳，在氯金酸和柠檬酸三钠添加量分别为3.0 mL和2.7 mL时，拉曼增强信号最强，增强因子EF（三聚氰胺）=2.7×103，EF（西地那非）=2.1×103。

表3 三聚氰胺和硝苯地平检测数据表

表4 硝苯地平定量数据表

2.4 以三聚氰胺为内标对硝苯地平样品的定量检测

2.4.1 内标的选择以及标准曲线的绘制

试验选择加入50 mg/kg的三聚氰胺作为内标，以硝苯地平浓度为横坐标，以硝苯地平特征峰1334 cm-1与三聚氰胺表面增强拉曼特征峰707cm-1的峰高比为纵坐标进行线性回归拟合（I1334/I707），由图5可以看出在0～100 mg/kg质量分数范围内，峰高比（I1334/I707）与西地那非浓度呈良好线性关系，线性拟合相关系数R2=0.9958，由此可以说明表面增强显微拉曼光谱法定量检测保健食品中非法添加物西地那非具有可行性。

图5 硝苯地平定量表面增强拉曼光谱图

图6 硝苯地平定量线性曲线

图7 硝苯地平定性检测拉曼光谱图

2.4.2 加标样品定量检测以及检出限

试验选取经国标检测方法筛选出不含硝苯地平、尼群地平、尼莫地平阴性样本2个，其中1个为胶囊丸，1个为液体，编号分别为A、B。按照试验的样品前处理方法对3个样品进行前处理，添加一定浓度的硝苯地平标准品溶液，使得样品质量分数为20，50和80 mg/kg，编号为A-1，A-2，A-3，B-1，B-2和B-3，结果如表5所示。固体加标样品方法的回收率为88.8%～96.5%，SRSD为4.17%，液体加标样品的方法回收率为90.2%～96.6%，SRSD为3.49%，加标样品的测试结果表明表面增强显微拉曼光谱法可满足保健食品中硝苯地平含量的定量检测要求。

表5 实际样品中硝苯地平测定

2.5 方法检测限

设置一系列质量分数0，5和10 mg/kg硝苯地平标准品，空白无峰出现，5和10 mg/kg均出现硝苯地平的拉曼特征光谱图，其定性检测线为5 mg/kg。对于一些低含量样品的检测，可采取氮吹的方式对提取液进行浓缩。

3 结论

基于便携式拉曼光谱技术，制备增强试剂胶体金以及对保健食品中非法添加硝苯地平的进行定性、定量检测。对于制备的增强试剂胶体金的性能评价采取目测评价、紫外光谱表征及标准品测试。结果表明，拉曼增强试剂胶体金制备的最佳比例为100 mL超纯水中加入3.0 mL 1%氯金酸和2.7 mL 1%柠檬酸三钠，其中标品测试物三聚氰胺及西地拉非展现出较强的指纹图谱信号。对于保健品中非法添加降血压药物硝苯地平的定性结果表示，在拉曼图谱（1334±3）cm-1和（1642±3）cm-1处有明显特征峰，可用于该类药物的定性检测。另外，表面增强拉曼光谱法以50 mg/kg三聚氰胺作为内标定量保健食品中硝苯地平含量结果显示，该方法检测限为5 mg/kg，线性回归方程为y=0.0223x+0.1457，线性相关系数为0.9957，固体试样加标回收率为88.8%～96.5%，液体试样加标回收率为90.2%～96.6%，与液相质谱对比显示出方法的可靠性。

便携拉曼对于食品中非法添加物的检测具有灵敏度高、特异性强、检测耗时少等优点，可用于对大量样品的定性、定量筛查，而得到较强的拉曼图谱信号的关键在于制备有效的增强试剂材料。试验发现，当胶体金粒径在一定范围中增大时，对待测物的拉曼检测图谱响应越强，但是粒径增大到一定量时效果减小，原因是胶体金团聚沉淀，从而失去增强效果。试验对后续增强材料的制备提供基础方法及思路，同时，以三聚氰胺作内标定量硝苯地平，为保健品中非法添加降血压类药物硝苯地平提供备选方法。