顶空固相微萃取法分析葡萄蒸馏酒香气中酯类成分差异

朱捷，何微, ，高琳，李瑞雪，郑国涛

1.宁夏回族自治区食品检测研究院（银川 750002）；2.南京农业大学（南京 210095）；3.宁夏镇北堡酒业有限责任公司（银川 750026）

葡萄蒸馏酒作为葡萄及葡萄酒的深加工产品，以其独具特色的口味和营养价值，吸引众多消费者，它是以葡萄为原料，经发酵、蒸馏、勾兑而成的饮料酒[1]。葡萄蒸馏酒虽然与传统白酒一样，有着较高的酒精度，含有多种酯类，但又区别于传统酿造的粮食白酒[2-3]。根据国内外学研究，构成葡萄蒸馏酒的香气成分有500余种[4]，主要包括酯类、醇类、酸类、萜烯类、醛酮类等[5-6]化合物。这些化合物的组成和含量受葡萄品种、种植产区、栽培模式和葡萄采收期等[7-11]因素的影响，其中葡萄品种被认为是影响葡萄蒸馏酒香气成分最主要的因素[12]。周洪江等[13]研究烟台产区以“白玉霓”“赤霞珠”“蛇龙珠”3种酿酒葡萄为原料酿造的葡萄蒸馏酒中香气成分，找到26种酯类物质，占香气成分的46.75%～63.39%，研究发现不同品种的蒸馏酒中酯类物质种类及含量各不相同，且具有各自特点，其中壬酸乙酯是白玉霓的特征酯类。王鑫等[14-15]对比研究杨凌地区“霞多丽”“爱格丽”“小芒森”等5个品种葡萄蒸馏酒的香气成分，结果发现“爱格丽”蒸馏酒香气更为浓郁，对其香气贡献最大的主要是乙酯类成分。曹佩佩[16]分析“夏黑”“户太八号”“黄玫瑰”“巨玫瑰”“摩尔多瓦”5个鲜食品种蒸馏酒，结果发现“巨玫瑰”蒸馏酒中醇类物质含量与酯类含量相近，其他蒸馏酒中醇类物质含量均明显高于酯类物质含量，其中“摩尔多瓦”蒸馏酒中醇类物质总量占比最高达61.20%，“户太八号”“黄玫瑰”“巨玫瑰”“爱格丽”蒸馏酒中酸类物质含量较多且相近。

酯类物质是葡萄蒸馏酒香气成分中的主要成分，也是反映葡萄蒸馏酒品质的重要参考，要进行分析就必须将酯类成分提取浓缩和分离检测。GC-MS是分析酒精饮料挥发性物质最常见的方法[17-18]，而顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HSSPME）作为固相微萃取的一种，其具有效率高，自动化程度高、可多平台联用等优势，在挥发性成分富集分析中具有明显的优势[19-20]，但在HS-SPME使用过程中萃取温度、萃取时间、解吸时间、平衡时间等因素都影响着酯类物质的检测结果，而对于这部分的研究较少。

综合而言，不同品种葡萄对生产出的葡萄蒸馏酒中酯类物质的影响研究得还不够深入，且鲜见关于贺兰山东麓产区葡萄蒸馏酒中酯类物质的报道和研究。试验以贺兰山东麓产区酿酒葡萄“赤霞珠”“蛇龙珠”“美乐”“西拉”“黑比诺”为原料生产的葡萄蒸馏酒为研究对象，优化HS-SPME萃取条件，通过HSSPME与GC-MS联用的方法，比较其香气成分中酯类物质的差异，以期为贺兰山东麓产区葡萄蒸馏酒品质研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料概况

葡萄蒸馏酒由宁夏镇北堡酒业有限责任公司生产，该公司所用葡萄原料均采自于贺兰山东麓产区（2022年），分别为“赤霞珠”“蛇龙珠”“美乐”“西拉”“黑比诺”5种酿酒葡萄，采用塔式蒸馏器进行蒸馏，酒精度均为56%vol。

1.2 试剂

NaCl（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；3-辛醇（99.7%，坛墨质检标物中心）。

1.3 仪器与设备

7890B-7000C气相色谱-三重四极杆串联质谱仪（美国安捷伦科技公司）；PAL全自动固相微萃取进样系统（瑞士CTC公司）；DVB/CAR/PDMS一体化萃取进样针（瑞士CTC公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理

取葡萄蒸馏酒样品，用超纯水将样品稀释至酒精度15%vol后准确吸取8 mL，加入带有聚四氟乙烯密封盖的顶空进样瓶中，加入0.1 g/mL NaCl，密封小瓶。

1.4.2 气相色谱及质谱条件

色谱柱：DB-WAX UI气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度230 ℃；载气为高纯氦气（He）；不分流进样；流速1 mL/min。升温程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至170 ℃，保持8 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持11 min。

EI离子源：电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度240 ℃；质量扫描范围50～500 amu。

萃取针为DVB/CAR/PDMS型。

1.4.3 HS-SPME萃取条件优化

取同种待测样品，按照1.4.1步骤处理样品，以分离得到酯类物质色谱峰的总峰面积和峰个数为参考指标，对不同萃取温度（25，30，35，40，45，50，55和60 ℃）、不同平衡时间（0，5，10，15，20，25，30和35 min）、不同萃取时间（10，20，30，40，50，60和70 min）、不同解吸时间（1，3，5，7和9 min）进行单因素试验，每个样品重复3次。

1.4.4 定性与定量分析

试样制备方式按1.4.1中步骤进行，并加入40 μL、500 μg/mL的3-辛醇内标溶液，根据优化后的条件设置固相微萃取参数。

定性分析：将GC-MS检测的化合物质谱图与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）普库Ⅱ进行数据比对。

定量分析：使用安捷伦MassHunter定量分析软件，采用内标法计算酯类物质的相对含量，按式（1）计算。

1.4.5 数据处理

试验重复测定3次，结果以“平均值±标准差”表示，用Excel 2016、SPSS 25.0进行数据分析，采用P=0.05的显著性水平，Origin 2019作图。

2 结果与分析

2.1 固相微萃取条件的优化

2.1.1 萃取温度的选择

按1.4.1的步骤进行，设置固相微萃取进样系统平衡时间20 min、萃取时间30 min、解吸时间5 min、振摇频率10 s/min。在此条件下考察不同萃取温度（25，30，35，40，45，50，55和60 ℃）对结果的影响，结果如图1所示。

结果表明，随着萃取温度的增加，提取出的酯类物质也随之增加，35 ℃时酯类物质的个数及峰面积最大，因为萃取温度的升高会加速分子热运动，提高挥发性化合物的迁移率。但继续提高萃取温度后，酯类物质的个数及峰面积反而出现下降趋势，这可能是由于在顶空瓶的有限空间内，挥发性物质不断增加，低沸点物质因高沸点组分的竞争吸附而减少，降低在萃取纤维上的分配系数[21-22]，这个变化趋势也与赵馨馨等[23]、孙丽君等[1]的研究结果一致。因此选择35 ℃进行后续试验。

2.1.2 平衡时间的选择

平衡时间是在萃取纤维接触挥发性成分之前，待测成分在顶空和样品之间达到平衡所需时间。试验按1.4.1中步骤进行，旋紧瓶盖。设置固相微萃取进样系统萃取温度35 ℃、萃取时间30 min、解吸时间5 min、振摇频率10 s/min。在此条件下考察不同平衡时间（0，5，10，15，20，25，30和35 min）对结果的影响，结果如图2所示。

图2 平衡时间对萃取效果的影响

结果表明，随着平衡时间的增加，酯类物质也随之增加，平衡时间25 min时，酯类物质的个数及峰面积最大，因此确定平衡时间为25 min。

2.1.3 萃取时间的选择

萃取时间是从萃取纤维与试样接触到吸附平衡所需要的时间。试验按1.4.1中步骤进行，旋紧瓶盖。设置固相微萃取进样系统萃取温度35 ℃、平衡时间25 min、解吸时间5 min、振摇频率10 s/min。在此条件下考察不同萃取时间（10，20，30，40，50，60和70 min）对结果的影响，结果如图3所示。

图3 萃取时间对萃取效果的影响

结果表明，随着萃取时间的延长，样品组分不断的富集在萃取纤维中，萃取50 min后，峰面积达到最大值，随着萃取时间继续延长，富集的速度越来越慢，总峰面积趋于稳定，说明此时萃取纤维已接近平衡状态。萃取时间不断增加，被检测出的酯类物质的个数变化不明显，均在17～20个之间，综合2个结果，选取50 min为最佳萃取时间。

2.1.4 解吸时间的选择

试验按1.4.1中步骤进行，旋紧瓶盖。设置固相微萃取进样系统萃取温度35 ℃、平衡时间25 min、萃取时间50 min、振摇频率10 s/min。在此条件下考察不同解吸时间（1，3，5，7和9 min）对结果的影响，结果如图4所示。

图4 解吸时间对萃取效果的影响

结果表明，随着解吸时间的增加，酯类物质出峰个数及总峰面积增加，解吸5 min后达到最大值，但继续增加解吸时间，酯类物质个数及峰面积呈现先降低再升高的趋势，但解吸9 min后，酯类物质峰形明显变差。这是因为在同一温度下，解吸时间与挥发性组分从萃取纤维解吸附的程度密切相关，解吸时间较短会造成目标物解吸附不完全，而解吸时间长会也会影响出峰个数、峰面积及峰形，还会降低萃取头使用寿命，因此选取5 min为最佳解吸时间。

2.2 葡萄蒸馏酒香气中酯类物质分析结果

采用优化后的HS-SPME条件对5个品种葡萄蒸馏酒香气中酯类物质进行分析，结果见表1。葡萄蒸馏酒中酯类物质含量丰富，共检测出酯类26种，但5个品种的葡萄蒸馏酒中酯类物质的种类及相对含量差异显著。

表1 不同品种葡萄蒸馏酒中酯类成分GC-MS分析结果

5种葡萄蒸馏酒中共有的酯类为乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、己酸异戊酯、乳酸异戊酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸异戊酯、乙基异戊基琥珀酸酯共15种。其中辛酸乙酯的含量最高，“赤霞珠”“蛇龙珠”“美乐”“黑比诺”4种葡萄蒸馏酒差异不显著，均占酯类物质总量的40%以上。其次按含量大小依次为丁二酸二乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸乙酯，这5种酯类与辛酸乙酯占各类葡萄蒸馏酒中总酯的95%以上。

按葡萄品种来看，“赤霞珠”葡萄蒸馏酒中酯类物质较为丰富，其乙酸异戊酯、己酸异戊酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、水杨酸甲酯、乙酸苯乙酯和月桂酸乙酯的含量较高且与其他四种葡萄蒸馏酒差异显著，而丁二酸二乙酯的含量却较低。此外，“赤霞珠”葡萄蒸馏酒中含有少量棕榈酸乙酯，而这种酯类物质在其他品种葡萄蒸馏酒中则基本未检出。“蛇龙珠”“美乐”“黑比诺”“西拉”葡萄蒸馏酒中酯类物质含量较为相似，其中“美乐”葡萄蒸馏酒中含有少量的戊酸乙酯和丙酸异戊酯，这2种酯类是在其他几种葡萄蒸馏酒中少见的，与此同时该葡萄蒸馏酒中又未检出乙基-9-癸烯酸酯和水杨酸甲酯。从检测结果可以看出，不同品种葡萄蒸馏酒中酯类物质含量及种类差异较大，正因如此，也造就葡萄蒸馏酒不同风味和口感。

3 讨论

3.1 固相微萃取条件的优化

固相微萃取是集合萃取吸附、顶空进样的一种技术，萃取温度、萃取时间、解吸时间、平衡时间等因素都对结果有较大影响，国内外学者采用的萃取条件多集中于整体香气成分的检测[1,18,23,25]，没有专门针对酯类物质的条件参数，在试验过程中对比发现，将蒸馏酒稀释至酒精度15%vol后测定挥发性酯类香气物质的成分，可以避免过高酒精度导致基质效应的影响，这也与孙丽君等[1]、成池芳等[2]的研究结果相近。但在NaCl添加量的优化上，试验与其他香气成分的研究[1,8]不同，添加0.1 g/mL NaCl时酯类物质出峰个数及总峰面积就达到最大值，因为NaCl的添加可以影响挥发性组分在气液两相的平衡，向液体样品中添加NaCl溶液有助于酯类物质的检出，但NaCl含量过高时，基质黏度增加，挥发性组分扩散速度降低[24]。因此，选取添加0.1 g/mL NaCl进行后续试验。此外，探讨不同萃取针对酯类物质检出的影响，研究发现采用PDMS萃取针仅仅富集得到5种酯类物质，且总峰面积明显低于复合纤维的萃取针，其富集的酯类分别为己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕榈酸乙酯及月桂酸乙酯。DVB/PDMS萃取针则在该基础上多富集部分酯类物质。对比3种萃取针可以看出，DVB/CAR/PDMS萃取针对于葡萄蒸馏酒香气中酯类物质的萃取效率明显高于其他两种萃取针，因此选择DVB/CAR/PDMS萃取针进行后续试验。

3.2 不同产区葡萄蒸馏酒香气中酯类物质差异

传统粮谷类蒸馏酒中以乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯占主要地位，而葡萄蒸馏酒中酯类物质含量及组成则大不相同，这使得葡萄蒸馏酒的风味区别于传统蒸馏酒。试验发现贺兰山东麓产区葡萄蒸馏酒中酯类物质以辛酸乙酯的含量最高，丁二酸二乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯含量次之，这个结果也与其他产区的葡萄蒸馏酒有所区别[13-16,25]，如：周洪江等[13]研究烟台地区3种葡萄品种原白兰地发现，癸酸乙酯含量最高，己酸乙酯及辛酸乙酯含量次之，其中“白玉霓”葡萄蒸馏酒中含有较高的壬酸乙酯；王鑫等[14]发现杨凌地区主要葡萄蒸馏酒的香气成分中辛酸乙酯、癸酸乙酯含量最高，两者约占酯类总量的70%以上，其次还检出较高含量的正己酸乙酯及乙酸乙酯；赵馨馨等[23]发现新疆石河子地区葡萄蒸馏酒中月桂酸乙酯含量很高，仅次于癸酸乙酯；孙丽君等[1]发现河南地区葡萄蒸馏酒中丁二酸二乙酯含量很低，这与贺兰山东麓产区的葡萄蒸馏酒差异较大。

4 结论

试验通过对影响HS-SPME结果的各种条件进行优化，得到的最佳萃取条件：选择DVB/CAR/PDMS萃取纤维，样品酒精度15%vol，添加0.1 g/mL NaCl，萃取温度35 ℃，平衡时间25 min，萃取时间50 min，解吸时间5 min。采用优化后的条件分析贺兰山东麓产区葡萄蒸馏酒，共鉴定出26种酯类物质，辛酸乙酯含量最高，其次为丁二酸二乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸乙酯，这6种酯类物质占各类葡萄蒸馏酒中总酯的95%以上，不同品种葡萄蒸馏酒中酯类物质的种类及含量各不相同。试验不但为葡萄蒸馏酒生产选料提供参考，也为后续贺兰山东麓产区与其他产区葡萄蒸馏酒香气成分差异的研究提供理论依据与数据支撑。