酱油品质指标的比较与抗氧化能力的研究

张智勇，王宇婷，熊思瑞，周明印，乔祺，金铁岩

延边大学农学院（延吉 133002）

随着“健康中国”口号的打响，越来越多的消费者选择食品的最大关注点不仅局限于口味，也在向注重健康以及功能性方面靠拢。酱油中除了原料大豆中本身含有的不饱和脂肪酸、多糖、大豆异黄酮等物质，还会在发酵过程中由微生物代谢生产出的生理活性物质，如多肽、类黑精、呋喃酮等[1]。酱油作为人们日常生活中不可或缺的调味品，具有极高的营养价值。根据研究表明，酱油具有抗氧化活性、抗高血压、抗高血脂、抗肿瘤活性、抗过敏活性等[2]作用。酱油除了作为满足人们日常需求的调味品外也是摄取生理活性成分的重要载体，在日常生活中可以从酱油中摄取生理活性成分。酱油含有多种抗氧化剂，如酚类化合物、异黄酮、类黑素、游离氨基酸和超氧化物歧化酶，染料木苷与大豆苷等具有很强的抗氧化活性，它们是酱油中异黄酮类物质的主要组成。而类黑素是由酱油在美拉德反应中生成的一种褐色色素，这种褐色色素内部具有稳定的自由基结构，且不会受到消化酶影响，能够消除羟自由基、过氧化物等[3]。已报道关于酱油生理活性功能的研究探索很少，对酱油风味和酿造工艺的相关研究也较少，所以全面加强酱油营养以及提高酱油品质质量是当前研究的关键。试验以木桶发酵酱油为原料，分析其一般成分、功能性成分及抗氧化活性，为今后研发功能性酱油提供理论依据与数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料

木桶发酵酱油由好记食品酿造股份有限公司提供（代号S1）；其余5种均购于延吉市百货大楼超市（代号分别为S2、S3、S4、S5、S6）。试验所用酱油试样信息如表1所示。

表1 6组酱油的基本信息

1.1.2 试验仪器与设备

分析天平（YP2002，上海科教仪器有限公司）；pH计（FE28，梅特-托利多精密仪器有限公司）；色差仪（CM-5，日本柯尼卡美能达公司）；紫外可见分光光度计（Alpha-1900Splus，上海谱元仪器有限公司）；电感耦合等离子体质谱仪（PlasmaQuant MS，德国耶拿公司）；氨基酸自动分析仪（L-8900，岛津上海实验器材有限公司）；原子吸收光谱仪（ICE 3300，赛默飞世尔科技中国有限公司）；恒温水浴锅（HH-2，天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030，上海一恒科学仪器有限公司）；恒温气浴振荡器（THZ-72S5，常州市国旺仪器制造有限公司）。

1.1.3 试验试剂

石油醚、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、溴甲酚绿指示剂、无水乙醇、1,1-2-苦肼基（DPPH）标准品、ABTS标准品、盐酸、硫酸、过氧化氢、水杨酸、钼酸铵、磷酸钠等（均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；水使用GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和实验方法》规定的一级水。

1.2 试验方法

1.2.1 酱油理化指标的测定

1.2.1.1 铵盐含量参照GB 5009.234—2016《食品安全国家标准食品中铵盐的测定》测定酱油中铵盐含量。

1.2.1.2 氯化钠含量

参照GB 18186—2000《酿造酱油》测定酱油中氯化钠含量。

1.2.1.3 氨基酸态氮及总酸含量的测定

参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计法，测定酱油中氨基酸态氮及总酸含量。

1.2.2 酱油中矿物质含量的测定

参照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》中电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）进行测定。

1.2.3 酱油色度的测定

使用柯尼卡美能达CM-5型色差仪测定酱油的色度。

1.2.4 酱油中氨基酸含量的测定

1.2.4.1 酱油氨基酸成分检测

酱油前处理参照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》中的方法对酱油进行水解。

1.2.4.2 酱油氨基酸营养价值评价

根据联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）推荐的模式[4-5]，蛋白质的营养价值需使用必需氨基酸评分对其进行评价，具体如式（1）所示。

1.2.5 酱油中多酚和总黄酮含量测定

1.2.5.1 酱油中多酚含量的测定

以没食子酸作为标准品进行定量。参考舒更新[6]的方法测定总酚含量。绘制标准曲线，方程为y=0.0145x-0.0564（R2=0.9998）。

1.2.5.2 酱油中总黄酮含量的测定

根据杨春霞等[7]的方法稍作修改，测定总黄酮含量。绘制标准曲线，方程为y=0.0011x+0.0318（R2=0.9985）。

1.2.6 酱油的体外抗氧化活性

1.2.6.1 酱油的DPPH自由基清除能力

用蒸馏水配制质量浓度分别为0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/mL的酱油溶液，作为待测样品备用。取2 mL待测样品加入2 mL 0.04 g/L的DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，反应20 min，测其在517 nm波长处吸光度，记为A1；另取2 mL待测样品加入无水乙醇2 mL，反应20 min，测其在517 nm波长处吸光度，记为A2；测定2 mL 0.04 g/L DPPH无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇在517 nm波长处吸光度A0，所有测定平A0行进行3次，取平均值。通过式（2）计算酱油对DPPH自由基清除率（%）。

式中：A0为样品+DPPH的吸光度的吸光度；A1为样品+无水乙醇的吸光度的吸光度；A2为无水乙醇+DPPH的吸光度。

1.2.6.2 酱油的ABTS+自由基清除能力

7 mmol/L ABTS+与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，于室温静置16 h，制备成ABTS+储备液。临测前使用溶液将储各液稀释至吸光度2.00±0.10工作液。将酱油试样用蒸馏水配制质量浓度分别为0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/mL的溶液，作为待测液备用。取0.3 mL样品溶液与3 mL ABTS充分混匀6 min后于734 nm处测定吸光度Ai；同样方法，取3 mL蒸馏水与0.3 mL样品溶液混合，测定吸光度Aj，取3 mL ABTS与0.3 mL蒸馏水混合，测定吸光度A0，通过式（3）计算酱油溶液对ABTS自由基清除率（%）。

式中：Ai为样品组吸光度；Aj为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.2.6.3 酱油的铁离子还原能力

分别移取5 mL质量浓度0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/mL的酱油稀释液于试管中，加入pH 6.6的磷酸盐缓冲液和浓度0.1%的铁氰化钾溶液各5 mL，50 ℃下保温25 min后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液。取5 mL反应好的溶液后加入5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%三氯化铁溶液后静置10 min，在700 nm处测定其吸光度[8]。

1.2.6.4 酱油的总抗氧化能力

酱油用蒸馏水配制成质量浓度分别为0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/mL的酱油溶液样品，备用。取0.4 mL酱油稀释液，加入4 mL磷钼酸试剂（28 mmol/L磷酸钠、0.6 mol/L浓硫酸和4 mmol/L钼酸铵），在95 ℃恒温水浴90 min，测定695 nm波长处吸光度[9]。

2 结果与分析

2.1 酱油理化指标的分析

由表2可知，不同酱油试样间的的氨基酸态氮、氯化钠、全氮、乙醇、无盐固形物、铵盐含量存在差异。氨基酸态氮的含量在0.97～1.28 g/100 g之间，S2与S5含量显著低于其他4种，S1显著高于其他5种。氯化钠含量在15.68～16.66 g/100 mL之间，S1与S3氯化钠含量最低，二者之间无显著性差异，S2与S5含量最高并无显著性差异，而S4的氯化钠含量与S1、S3之间无显著性差异但显著低于S6。全氮含量在1.64%～2.17%之间，蛋白质含量在10.14%～13.58%之间，各组酱油试样之间存在显著差异（P＜0.05），S1全氮含量（2.17%）均显著高于其他5组试样，按照由高到低的顺序依次为S1＞S3＞S6＞S4＞S2＞S5。在乙醇含量上，S3显著高于其他5组酱油试样，含量为2.41%，S1乙醇含量最低，为1.18%。6组试样的无盐固形物含量在22.90～28.34 g/100 mL之间，S4含量为28.34 g/100 mL，显著高于其他5组，S6与S1、S3之间无明显差异，但S1无盐固形物含量显著高于S3，S2无盐固形物含量为最低。铵盐含量在0.20～0.32 g/100 mL之间，S1的铵盐含量显著高于其他5组酱油，S4的铵盐含量为最低，但与S2、S5之间无显著性差异，S6与S2之间无显著性差异，S3与S2、S6之间无显著性差异，但S3显著高于S5和S4。S4的pH显著高于其他5组，S3与S6之间明显差异，但却显著高于S1、S2和S5。

表2 6组酱油的理化指标

2.2 酱油中矿物质含量的分析

由表3可知，酱油中含有宏量元素4种分别为钾、钙、钠和镁，微量元素5种分别为铁、锌、硒、锰和钼。宏量元素钾含量最高的是S6，含量为5628.73 mg/kg；钙含量最高的S1，含量为185.77 mg/kg；钠含量最高的为S2，含量为48845.67 mg/kg；镁含量最高的为S3，含量为850.60 mg/kg。微量元素种铁含量最高的是S4，含量为26.12 mg/kg，显著高于其他5组酱油（P＜0.05）；锌含量最高的为S6，含量显著高于其他5组，为8.44 mg/kg，S4的锌含量最低，含量为6.47 mg/kg；微量元素硒含量S1含量为0.06 mg/kg，显著低于其他5组，其他5组之间的硒含量无显著性差异；S3锰含量为最高，为16.71 mg/kg，钼含量S5最高，为0.39 mg/kg，S1最低，为0.13 mg/kg。

表3 6组酱油矿物质元素的含量 单位：mg/kg

2.3 酱油色度的分析

6种零添加酱油色度的比较如表4所示。6组酱油试样的L*值、a*值、b*值均存在显著性差异（P＜0.05）。还可以看出6组酱油试样的L*值、a*值、b*值按高低顺序依次为S6＞S5＞S4＞S3＞S2＞S1。S1酱油试样的L*值、a*值、b*值均显著低于其他5种酱油试样，酱油L*值、a*值、b*值的不同对酱油的成分味道无影响，对烹饪时酱油对菜肴的上色程度略有影响[10]。

2.4 酱油中氨基酸含量的分析

氨基酸的含量与酱油的营养、风味密切相关，是衡量其质量的一个重要指标[63]。由图1～图7可知，六组酱油试样的图谱与标准图谱相互对应，S1、S2、S3、S4、S5、S6分别检测出17种氨基酸，其中7种为必需氨基酸，通过酱油试样的峰面积计算出氨基酸含量，结果如表5所示。

图1 氨基酸标准图谱

图2 S1酱油试样氨基酸图谱

图3 S2酱油试样氨基酸图谱

图4 S3酱油试样氨基酸图谱

图5 S4酱油试样氨基酸图谱

图6 S5酱油试样氨基酸图谱

图7 S6酱油试样氨基酸图谱

表5 6组酱油中氨基酸含量 单位：g/100 g

由表5可知，酱油中氨基酸中种类多样，含量丰富，6组酱油试样均检测出17种氨基酸，S1、S2、S3、S4、S5、S6这6组酱油试样的氨基酸总量分别为4.71，3.15，3.95，3.66，3.14和3.39 g/100 g。人体必需氨基总量分别为1.50，1.07，1.38，1.10，1.09和1.14 g/100 g；非必需氨基酸总量分别为3.21，2.08，2.57，2.56，2.05和2.25 g/100 g。谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸在6组酱油中含量较高，比其他非必需氨基酸更丰富。谷氨酸参与许多重要的化学反应及生物代谢。半胱氨酸和酪氨酸含量相较其余15种相对较少。酱油含有7种人体必需氨基酸。除S6外，其他5组中必需氨基酸含量最高的种类为亮氨酸，在必需氨基酸中又有一部分氨基酸称为支链氨基酸，其中包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，亮氨酸负责促进蛋白质的合成和改善新陈代谢。它是支链氨基酸中最重要的一种[64]。而S6中赖氨酸的相对含量较高，赖氨酸对人体的发育具有有效的促进作用，增强免疫功能与中枢神经组织的功能。

在6组酱油试样中，S1支链氨基酸总含量为0.82 g/100 g，其次是S3支链氨基酸总含量（0.72 g/100 g）和S5支链氨基酸总量（0.58 g/100 g），最后是S2，S4和S6的支链氨基酸，总含量均为0.56 g/100 g。在6组酱油试样的支链氨基酸中亮氨酸含量最均为丰富，亮氨酸作为支链氨基酸中最重要成分，具有促进蛋白质合成和增加能量代谢等功效[11]。

从表6可以看出，6组酱油试样的呈味氨基酸总量按高低顺序依次为S1＞S3＞S4＞S6＞S2＞S5。在所有风味氨基酸中，与苦味氨基酸相比，S1的鲜味与甜味氨基酸的含量之和具有较高的差值。这说明S1在口感上很容易让人接受。

表6 6组酱油呈味氨基酸组成 单位：g/100 g

根据6组酱油中每组氨基酸含量，计算必需氨基酸在氨基酸总量中的质量分数，并将其与FAO/WHO的标准谱进行比较。从表6可以看出，S1与S4的苏氨酸比例低于FAO/WHO模式，只有S4的缬氨酸低于FAO/WHO模式。6组酱油的异亮氨酸比例整体高于FAO/WHO模式，亮氨酸比例只有S4和S6低于FAO/WHO标准模式，赖氨酸评分除S1外均高于FAO/WHO模式，6组酱油试样中蛋氨酸和苯丙氨酸的比例全部低于FAO/WHO的标准模式。说明6组酱油都具有一定营养价值。

由表7可知，6组酱油中的苯丙氨酸与蛋氨酸比例低于FAO/WHO评分模式，说明苯丙氨酸以及蛋氨酸含量较欠缺，苯丙氨酸缺乏会影响体内酪氨酸合成，从而导致甲状腺素水平降低[12]。蛋氨酸对人体内的氮元素代谢有着重要的作用，如果没有足够的蛋氨酸，就会让严重影响正常的新陈代谢，进而产生各种疾病。

表7 6组酱油7种必需氨基酸评分 单位：%

2.5 酱油体外抗氧化性的分析

2.5.1 酱油DPPH自由基清除能力

由图8可知，0.5 mg/mL时，6组酱油试样清除自由基能力为22.61%～33.72%。6组酱油试样的自由基清除能力以剂量依赖的方式提高，DPPH清除能力随着酱油浓度的增加而增加。这表明，酱油的质量浓度对抗氧化能力有直接影响，这与前人的研究一致[98]，即提取物的质量浓度越高，即多酚，与提取物的抗氧化活性直接相关[13]，因为多酚具有作为质子供体的能力[14]。酱油样品中的不同化合物可以以类似的方式受到影响。当S2的清除率达到91.57%时，其质量浓度为2 mg/mL，显著高于其余5组的清除率（P＜0.05）。3 mg/mL时，6组酱油试样的清除DPPH自由基能力趋于平缓。而S1显著高于其他五组酱油试样（P＜0.05），6组酱油试样的抗氧化活性IC50值分别为S1（0.704 mg/mL）、S2（0.888 mg/mL）、S3（0.751 mg/mL）、S4（0.846 mg/mL）、S5（0.838 mg/mL）和S6（0.987 mg/mL）。

图8 6组酱油的DPPH自由基清除能力

2.5.2 酱油ABTS自由基清除能力

由图9可知，酱油质量浓度与对ABTS自由基的清除能力呈正相关，且6组酱油清除ABTS自由基的能力与其清除DPPH自由基能力规律一致。

图9 6组酱油的ABTS自由基清除能力

质量浓度从0.1 mg/mL到0.5 mg/mL时，S1的清除率范围为12.57%～24.56%，在设定的每个浓度范围内都显著高于其他5组试样（P＞0.05）。1.0 mg/mL时，S1与S3对ABTS自由基的清除率没有显著差异。3 mg/mL时，S1表现出最高的ABTS自由基清除率（70.64%），高于S2、S3、S4、S5、S6对ABTS自由基的清除率（59.24%，65.79%，63.16%，59.49%和58.36%）。6组酱油试样除S2与S6之间无显著差异外，其他组样之间均有显著差异。由此看出，在试验浓度范围内，S1对ABTS自由基的清除能力较好，其IC50值为1.636 mg/mL。其余5组酱油的IC50值分别为S2（2.357 mg/mL）、S3（1.872 mg/mL）、S4（2.068 mg/mL）、S5（2.758 mg/mL）和S6（2.577 mg/mL）。结合前人的研究，不难得出酱油清除ABTS自由基的能力与DPPH自由基的清除能力相比之下较弱。酱油清除ABTS自由基的能力均较弱[15]。

2.5.3 酱油的铁离子还原能力

由图10可知，在铁离子还原试验中测得的吸光度越高，说明酱油的还原力越高，即其抗氧化能力越高。6组酱油的还原能力与质量浓度呈正相关，其还原能力随浓度的增大而增强。质量浓度0.1～1 mg/mL时，6组样品之间在同一浓度下的吸光度无明显差异，在0.1 mg/mL时S2显著高于其他五组，在0.5 mg/mL时S2除显著高于S1与S5外，与其余3组之间无显著差异（P＞0.05）。2 mg/mL时，6组酱油试样之间的铁离子还原能力开始出现显著差异，S3显著高于其余5组，S2与S1、S4之间无显著差异，但显著高于S5与S6，S6吸光度最低，为0.10。3 mg/mL时，S3与S4之间无显著差异，S1、S2、S4和S5之间也无显著性差异（P＞0.05），但S3显著高于S1、S2、S5和S6（P＜0.05），S6的吸光度最低，说明S6的铁离子还原能力低。3 mg/mL时，S3和S4具有较还原力。

图10 6组酱油的铁离子还原能力

2.5.4 酱油的总抗氧化能力

由图11可知，总抗氧化能力试验中测得的吸光度越大则表示酱油的抗氧化能力越强[16]，6组酱油的总抗氧化能力与质量浓度呈正相关，其能力随浓度的增大而增强。0.10和0.25 mg/mL时，6组样品之间在同一浓度下的吸光度无差异不明显。0.50～3.00 mg/mL时，S1的总抗氧化能力开始逐渐显现，显著高于其他5组，其他5组酱油之间的总抗氧化能力虽然较S1来说较弱，但可以从图中看出其总抗氧化能力与样品的质量浓度呈正相关关系，随着质量浓度的增大，样品的总抗氧化能力也在增强。S1的总抗氧化能力为6组试样中最强，吸光度为0.12。3.00 mg/mL时，吸光度为0.26，从上升趋势来看，S1的总抗氧化能力随着浓度的增大而逐渐增强。

图11 6组酱油的总抗氧化能力

3 结论

以木桶发酵酱油与玻璃纤维发酵罐发酵酱油为试验对象，研究二者之间的理化指标、氨基酸含量、矿物质元素含量，并且通过测定6组供试酱油的多酚与总黄酮含量，及6组供试酱油的体外抗氧化活性，进行比较研究。

结果表明，木桶发酵酱油的氨基酸态氮含量1.28 g/100 mL、全氮含量2.17%，均为6组试样中最高。6组酱油中检测出矿物质元素种类9种，分别为钾、钙、钠、镁4种宏量元素，以及铁、锌、硒、锰和钼5种微量元素。检测出氨基酸种类17种，木桶发酵酱油S1的氨基酸总量及必需氨基酸总量均为试验组中最高。所有酱油都含有总多酚和总黄酮，S1的多酚和黄酮类化合物含量（分别为4.43和1.87 mg/g）均高于另外5组酱油。6组酱油都具有一定的抗氧化能力。但木桶发酵酱油更加突出，6组酱油的还原能力和抗氧化能力随着质量浓度的增加而逐渐显现，在浓度相同的条件下，S1的抗氧化能力明显高于其他5组。在相关分析中，6组酱油的抗氧化能力与多酚和黄酮类物质，在相关分析中，6组酱油的抗氧化能力与多酚和黄酮类物质呈正相关。