婴幼儿配方食品中维生素D3检测方法比较研究

周艳华，李涛 ，卢岚，李萍

1.长沙环境保护职业技术学院（长沙 410004）；2.湖南省产商品质量检验研究院，食品安全监测与预警湖南省重点实验室（长沙 410111）

维生素D具有类固醇的环戊氢稀环结构，是一种类固醇激素，对人体具有功能活性是维生素D2和维生素D3，经人体代谢为降钙三醇后，与VDR结合发生作用[1-3]。维生素D主要功能为促进钙吸收，调节钙、磷代谢，促进骨骼健康[4-7]。此外，维生素D还在免疫调节[8]、心血管疾病[9]、炎症反应[10]等方面发挥重要作用。维生素D在营养强化食品、保健食品、药品和饲料中均应用广泛[11-13]。研究表明维生素D对于婴幼儿的过敏性疾病、自身免疫调节和呼吸系统疾病有重要影响[14-16]。由于维生素D获取来源单一，婴幼儿普遍存在维生素D缺乏[17]。婴幼儿配方食品是婴幼儿获取维生素D的重要来源，产品通常营养强化维生素D3，且允许含量范围相对较窄，因为过量摄入维生素D存在毒副作用[18-19]，因此准确检测婴幼儿配方食品中的维生素D具有重要意义。

食品中维生素D检测方法主要有HPLC-UV法[20]、二维液相色谱法[21]、LC-MS/MS法[22-23]和免疫分析法[24]等，现有国家标准GB 5009.82—2016[25]中第三法为超高效液相联用质谱法，第四法为正向制备-反向液相色谱法。婴幼儿配方食品生产工艺复杂，应用现有检测方法检测婴幼儿配方食品存在重复性差和取样代表性不够等问题，不适用于特殊医学用途婴幼儿配方食品检测，现标准方法还存在操作复杂，试剂耗费量大且无法大批量样品检测等问题。此研究将着重于优化样品前处理方法，解决样品代表性不够、无法批量检测问题，应用于特殊医学用途配方食品的检测。对超高效液相联用质谱法和液相色谱法进行了比较研究，评价两种检测方法的等效性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂乳粉、婴幼儿配方奶粉、特殊医学用途配方食品、营养米粉（市售）；维生素D2（纯度：99.3%）、维生素D3（纯度：98.8%）：北京坛墨公司；维生素D3-d3（100 μg/mL，天津阿尔塔公司）；甲醇、乙酸铵、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、无水乙醇（色谱纯）、氢氧化钠、抗坏血酸、2,6-二叔丁基对甲酚、石油醚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantis型UPLC-MS/MS（美国赛默飞公司）；Vanquish液相色谱仪（美国赛默飞公司）；LC-6AD半制备液相色谱仪（日本岛津公司）；BSA224S电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

分别精密称取维生素D2和维生素D3，用无水乙醇溶解为质量浓度1.0 mg/mL的标准储备液，参考国家标准附录进行校正，并配制1.0 μg/mL的标准使用液和标准线性系列溶液。精密量取维生素D3-d3内标溶液，用甲醇配制1.0 μg/mL的内标使用液。

1.3.2 样品前处理

试样制备：准确称取25 g样品至250 mL玻璃瓶中，加入约200 g 45 ℃温水，充分混合溶解（营养米粉需加入1.0 g淀粉酶，于60 ℃酶解30 min），准确称取10.00 g（依据样品质量和加水质量计算制备液中试样质量）制备后的溶液至50 mL离心管。含试样离心管中加入100 ng维生素D3-d3内标溶液或1.0 μg维生素D2溶液（液相色谱法），加入0.4 g抗坏血酸，并加入12 mL 0.2 g/100 mL BHT乙醇溶液和6 mL 50%氢氧化钾（质量分数）溶液，涡旋30 s后放入恒温振荡器中，于80 ℃避光皂化30 min。

超高效液相联用质谱法净化：皂化液冷却后加入20 mL正己烷，振荡提取后离心，转移上层清液并水洗至中性，上层正己烷提取液过硅胶固相萃取柱净化液，净化液氮吹至干，经1.0 mL甲醇复溶后过膜上机。

液相色谱法净化：皂化液冷却后加入20 mL石油醚，振荡提取后离心取石油醚层，重复提取1次，合并石油醚层，石油醚提取液经水洗至中性，氮吹至干，用1.0 mL正己烷溶解，过膜后参考国家标准，用半制备高效液相净化，净化液氮吹至干，经0.5 mL甲醇复溶后过膜上机。

1.3.3 仪器条件

超高效液相联用质谱法仪器条件：赛默飞GOLD C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）色谱柱；流动相体系，流动相A为0.1%甲酸（含5 mmol/L乙酸铵溶液），流动相B为甲醇；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样体积为5 μL；梯度洗脱程序：0～2.0 min，90% B，2.0～3.0 min，90% B→100% B，3.0～7.0 min，100% B，7.0～7.1 min，100% B→90% B，7.1～10.0 min，90% B。在HESI离子源下，质谱参数见表1。

表1 维生素D3的质谱参数表

液相色谱法仪器条件：迪马Diamonsil C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）色谱柱；流动相体系，流动相A为水，流动相B为甲醇；流速0.8 mL/min；柱温35℃；进样体积为50 μL；等度洗脱程序：0～40.0 min，95% B，检测波长：264 nm。

1.3.4 方法学验证

在空白脱脂奶粉中添加适量浓度的维生素D3（超高效液相联用质谱法添加水平为1.0 μg/100 g，液相色谱法添加水平2.0 μg/100 g），按照空白标准偏差法评估检出限（LOD），即将空白样品加入定量限浓度的加标样品独立测试10次，计算其检测结果的标准偏差（S），3 s即为方法检出限。在空白脱脂奶粉中加入一定浓度的维生素D3[超高效液相联用质谱法添加水平为1.0，10和30 μg/100 g（n=6），液相色谱法添加水平为2.0，10和20 μg/100 g（n=6）]，测定结果并计算回收率和相对标准偏差值，研究方法准确度和精密度。

2 结果与分析

2.1 维生素D标准品色谱图

配制标准溶液，按1.3.3小节仪器条件分别在超高效液相联用质谱和液相色谱仪进样，维生素D3液质定量离子色谱图见图1，维生素D2和维生素D3液相色谱图见图2。由图1可知，液质联用法检测时维生素D3和维生素D3-d3保留时间一致，峰型与响应度均良好，维生素D3和其内标化学性质一致，可消除前处理操作的影响，也能降低液质检测器带来的基质效应，使得检测结果准确可靠。由图2可知，液相色谱法检测维生素D3时，维生素D2作为内标，维生素D2和维生素D3分离度良好，不影响维生素D3的定性定量。婴幼儿配方食品中营养强化维生素D时通常添加维生素D3，以维生素D2作为内标可保证定量结果准确的同时降低检测成本。对比两种方法可知，液质联用法可在8 min内完成检测，而液相色谱法需40 min才能完成检测，液质联用法更高效。

图1 维生素D3标准溶液定量离子色谱图

图2 维生素D液相色谱图

2.2 线性关系、检出限和定量限结果分析

由表2可知：超高效液相联用质谱法检测维生素D3在20～400 μg/L内呈良好线性关系，相关系数R2=0.9987，检出限（LOD）为0.264 μg/100 g，定量限（LOQ）为0.879 μg/100 g，液相色谱法检测维生素D3在50～1000 μg/L内呈良好线性关系，相关系数R2=0.9998，检出限（LOD）为0.405 μg/100 g，定量限（LOQ）为1.35 μg/100 g。对比两种检测方法可知，检测维生素D3时液相色谱法检测范围更大，但检出限和定量限高于超高效液相联用质谱法，表明超高效液相联用质谱法的灵敏度更高。

表2 维生素D3的线性、相关系数、检出限和定量限

2.3 准确度和精密度结果分析

表3为超高效液相联用质谱法检测维生素D3的回收率与精密度，表4为液相色谱法检测维生素D3的回收率与精密度。由表3可知：当维生素D3添加水平为1.0 μg/100 g时，回收率为93.2%，相对标准偏差SRSD为13.0%；当添加水平为5.0 μg/100 g时，回收率为88.0%，相对标准偏差SRSD为4.8%；当添加水平为10.0 μg/100 g时，回收率为97.6%，相对标准偏差SRSD为9.9%。由表4可知：当维生素D3添加水平为2.0 μg/100 g时，回收率为89.8%，相对标准偏差SRSD为3.8%；当添加水平为10.0 μg/100 g时，回收率为93.8%，相对标准偏差SRSD为2.0%；当添加水平为20.0 μg/100 g时，回收率为100.3%，相对标准偏差SRSD为3.5%。对比两种检测方法可知，采用超高效液相联用质谱法和液相色谱法测定维生素D3在低、中、高三个添加水平下有良好的加标回收率和精密度，符合GB/T 27404—2008[26]中检测方法确认技术要求。优化后前处理方法在保证样品具有代表性的同时不影响检测结果的准确度，结果表明检验方法准确可靠，满足方法学要求。

表3 维生素D3回收率和精密度（超高效液相联用质谱法）

表4 维生素D3回收率和精密度（液相色谱法）

2.4 不同检测方法对比研究

从市场采购5份不同婴幼儿配方食品，包括营养米粉、婴幼儿配方奶粉和特殊医学用途配方奶粉，样品覆盖所有婴幼儿配方食品类别，运用超高效液相联用质谱法和液相色谱法进行检测，对比检测结果，结果见表5。由表5可知，两种检测方法检测蛋白深度水解配方奶粉的结果差异最小，SRSD为0.66%，检测婴儿配方奶粉的结果差异最大，SRSD为9.7%，结果符合GB/T 27404—2008[26]中检测方法确认技术要求。

表5 婴幼儿配方食品中维生素D3含量测定结果（n=6）

3 结论

优化了婴幼儿配方食品中维生素D3的检测方法，解决了现有标准中样本代表性不够，不能批量检测的问题，并应用于营养米粉、婴幼儿配方奶粉和特殊医学用途配方奶粉的检测。样本采用大样量稀释复溶为液体乳状态，保证了样本的代表性，并采用小样量皂化提取，可适用于批量检测，节约了大量试剂，提高了检验效率。研究还比较了超高效液相联用质谱法和液相色谱法的检出限、定量限、线性范围、回收率和精密度，结果均符合相关标准要求。运用超高效液相联用质谱法和液相色谱法检测了5种代表性婴幼儿配方食品，维生素D3检验结果无显著性差异，表明两种方法的具有等效性，可应用于特殊医学用途配方食品的检测。超高效液相联用质谱法较液相色谱法灵敏度更高，检测效率更高，但维生素D3内标昂贵，液相色谱法需半制备液相，不同实验室可以依据现有条件选择方法进行婴幼儿配方食品的检测。研究表明维生素D对光照敏感[27]，为保证检测结果准确性，样品检测全程应在无紫外线光下进行。