基于网络药理学和分子对接技术探讨芪术肺纤汤治疗特发性肺间质纤维化的作用机制Δ

张雯静,王秋铭,李 萌,刘世刚,高 扬,李 辉,李国勤

(中国中医科学院广安门医院呼吸科,北京100053)

特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是以进行性肺纤维化为特征的间质性肺炎,临床多表现为喘息气短、干咳和活动后呼吸困难等,常伴有不可逆的肺功能丧失,病因不明,预后不良[1]。IPF患者确诊后的中位生存期仅有3～5年,发病率随年龄增长而升高[2]。目前,西医主要采用抗纤维化药物、糖皮质激素和免疫抑制剂等延缓疾病进展,不良反应大[3-4]。中医辨证施治IPF,可有效改善临床症状,提高患者生活质量。李国勤教授为我院首都名中医,对中医辨治IPF有独到见解,李教授认为IPF患者以气虚络痹为基本病机,本在肺脾不足,宗气亏虚,结局为久病及肾,痰瘀阻滞肺络贯穿始终,治疗应以补气通络为主[5-6]。芪术肺纤汤是李教授多年治疗IPF的经验所集,由黄芪、红景天、苦杏仁、党参、全蝎、莪术、黄精和巴戟天8味药组成,具有补益肺脾肾、化瘀祛痰的功效。前期临床研究结果证明,芪术肺纤汤可改善并延缓IPF患者的肺功能损害,减轻喘息咳痰等症状,增加运动耐量,改善患者生活质量[7-8]。但至今其药理作用机制尚未完全阐明,因此,从分子角度探索芪术肺纤汤治疗IPF的药理作用机制是非常必要的。本研究拟采用网络药理学方法和分子对接技术分析芪术肺纤汤治疗IPF的作用机制,以期为临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 获取芪术肺纤汤活性成分及靶点

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索芪术肺纤汤活性成分及靶点,利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)进行标准化处理;对于未检索到的全蝎和红景天,采用BATMAN数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)、中医药百科全书数据库(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)和本草组鉴数据库(http://herb.ac.cn/)获取活性成分后合并去重,通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取对应的Canonical SMILES号上传至Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/),研究物种选取“Homo sapiens”,条件设为“Probability>0”进行靶点预测,剔除无化学结构和无靶点者,将所有数据合并即为芪术肺纤汤的活性成分及靶点。

1.2 获取IPF疾病靶点

以“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”为关键词,“Homo Sapiens”为目标物种,检索GeneCards(https://genealacart.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM,https://omim.org/)和DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/),获取IPF疾病靶点。

1.3 获取芪术肺纤汤治疗IPF的核心靶点及PPI网络图

利用Venny 2.1.0在线软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将芪术肺纤汤与IPF靶点取交集并绘制韦恩图,导入STRING数据库(https://string-db.org),以“Homo Sapiens”为物种获得蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)关系,以“≥2倍的度值中位数”为条件利用Cytoscape软件(https://cytoscape.org/download.html)筛选得到芪术肺纤汤治疗IPF的核心靶点,绘制PPI网络图。

1.4 建立中药-成分-靶点-疾病网络图

筛选前30位核心靶点及对应成分,以节点表示中药成分、靶点、药物、方剂和疾病,边表示节点之间的相互关系,导入Cytoscape软件,构建中药-成分-靶点-疾病图。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)和Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)对交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,分别筛选P值排序居前10位的GO-生物过程(BP)、GO-分子功能(MF)和GO-细胞组成(CC)富集结果及排序居前20位的KEGG富集结果,采用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)制成柱状图进行可视化。

1.6 建立中药-成分-靶点-疾病-通路网络图

将前30位核心靶点、活性成分、药物、方剂、疾病、通路信息导入Cytoscape软件,构建中药-成分-靶点-疾病-通路图。

1.7 分子对接

筛选度值排序居前10位的核心靶点,通过反向分子筛选对应活性成分,利用TCMSP数据库获取mol2格式的活性成分3 D结构,未检索到3 D结构者通过PubChem数据库获取sdf格式,通过Open Babel GUI软件(http://openbabel.org/wiki/Category:Installation)转换为mol2格式;通过PDB蛋白质在线数据库(https://www1.rcsb.org/)下载前10位核心靶点的蛋白质结构,使用Autoduck vina软件(https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/)将靶点和活性成分虚拟对接,使用Pymol软件(https://pymol.org/2/)进行可视化图形展示。分子虚拟对接结合能<-17.77 kJ/mol,表示具有一定的结合活性,<-20.90 kJ/mol表示结合活性较好,<-29.26 kJ/mol表示结合效能更佳[9]。

2 结果

2.1 芪术肺纤汤活性成分及靶点

共获得芪术肺纤汤活性成分445个,对应靶点基因4 705个。其中,黄芪活性成分51个,靶点756个;红景天活性成分25个,靶点616个;苦杏仁活性成分76个,靶点780个;党参活性成分86个,靶点740个;全蝎活性成分5个,靶点170个;莪术活性成分60个,靶点507个;黄精活性成分27个,靶点373个;巴戟天活性成分115个,靶点763个。

2.2 IPF疾病靶点

通过GeneCards数据库获得3 523个IPF疾病靶点,DisGeNET数据库获得734个靶点,Drugbank数据库获得39个靶点,OMIM数据库获得13个靶点,OMIM genemap数据库获得347个靶点,合并去重后共获得IPF疾病靶点4 509个。

2.3 芪术肺纤汤治疗IPF的核心靶点

共获得456个交集靶点,筛选后得到101个核心靶点,可视化分析得出PPI网络图,见图1。图1中,靶点越大、颜色越深,表明节点度值越大,靶点越重要。度值排序居前10位的靶点有蛋白激酶B1(Akt1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、人β-肌动蛋白(ACTB)、肿瘤蛋白p53(TP53)、白细胞介素1β(IL-1β)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、转录激活因子3(STAT3)、转录因子AP-1(JUN)和表皮生长因子受体(EGFR)。

图1 芪术肺纤汤治疗IPF核心靶点的PPI图

2.4 中药-成分-靶点-疾病图

通过Cytoscape软件构建中药-成分-靶点-疾病网络图,表明芪术肺纤汤通过多成分、多靶点发挥对IPF的治疗作用,见图2。

红色节点表示药物名称,深蓝色节点表示方剂名称,深紫色节点表示疾病名称,橘黄色节点表示靶点,其余节点表示各个药物的活性成分。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

共获取GO富集结果1 148个,其中GO-BP、GO-CC和GO-MF分别有735、155和258个;KEGG富集结果196个。前30位GO富集结果三合一柱状图见图3;前20位KEGG结果柱状图见图4。表明芪术肺纤汤通过多通路治疗IPF,且磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路可能是涉及的最主要的信号通路,见图5。因临床对恶性肿瘤研究广泛,PI3K-Akt通路又属癌症通路和脂质与动脉粥样硬化通路范围内,因此,KEGG结果中虽然癌症通路和脂质与动脉粥样硬化通路数量较多,但不具代表意义。

图3 GO富集分析三合一柱状图

图4 KEGG富集分析前20条通路柱状图

绿色矩形为未识别蛋白,红色矩形为已识别蛋白。

2.6 中药-成分-靶点-疾病-通路图

利用Cytoscape软件,构建中药-成分-靶点-疾病-通路网络图,见图6。

绿色节点代表核心靶点,橘红色节点代表活性成分,粉色节点代表KEGG通路,蓝色节点代表药物,黄色节点代表方剂,紫色节点代表疾病。

2.7 分子对接结果

分子对接结果显示,大部分活性成分均能与靶点蛋白结合良好,其中以熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素与TP53、TNF、Akt1、IL-1β、IL-6、VEGFA结合能力较强,结合能<-20.90 kJ/mol者见表1,部分结合能<-29.26 kJ/mol的分子对接结果可视化见图7。

表1 芪术肺纤汤治疗IPF的前10位核心靶点与活性成分的分子对接结果

玫红色表示活性成分与靶点蛋白结合部分;黄色虚线表示连接氢键;白色表示残基名称。A.TP53-熊果酸;B.TP53-木犀草素;C.VEGFA-熊果酸;D.TNF-熊果酸;E.IL-1β-熊果酸;F.IL-6-熊果酸;G.TNF-芹菜素;H.Akt1-芹菜素;I.IL1β-槲皮素;J.Akt1-木犀草素;K.VEGFA-芹菜素;L.Akt1-山柰酚。

3 讨论

IPF为现代医学病名,中医一般归属为“肺痹”“肺痿”“咳嗽”和“喘证”等范畴。李教授认为,“肺痹”多为结缔组织病相关的间质性肺病,而IPF应属中医学“肺痿”范畴[10]。肺气亏虚,复感外邪,肺失宣肃而发咳喘,气病可及血,血病亦可及气,正如《素问·调经论》中记载,“血气不和,百病乃变化而生”。肺气虚则肺络血行不畅,凝而成瘀,故采用芪术肺纤汤,以黄芪、红景天为君,补肺活血、化瘀通络;瘀血停滞日久津液内停,化生痰浊,故臣以莪术活血祛瘀,全蝎搜风剔邪、活血通络;苦杏仁祛痰止咳、降逆平喘,主入肺经,引诸药直达病所;脾为生痰之源,肺为贮痰之器,肺病日久,致子盗母气,脾土运化失调,水液停积则聚而生痰,故又以党参为臣补肺健脾、益气养血,通过健运后天之本,也可达到祛痰益气的功效;痰瘀虚互结日久,病势缠绵,可累及脾肾,更佐以黄精、巴戟天补益肺肾、健脾和胃,祛痰化瘀而不伤正,气血调畅则病邪得解;全方补泻共施,具有化瘀祛痰、补益肺脾肾的功效。

现代药理学研究结果表明,黄芪可降低大鼠血清血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)水平,下调肺组织转化生长因子(TGF)β1、Smad3以及TGF-β1 mNRA水平,改善肺纤维化[11];红景天苷可下调Ⅰ型胶原蛋白、肌动蛋白和纤连蛋白等,防治TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞纤维化改变[12];苦杏仁苷可调控TGF-β/Smad通路,降低Smad2和Smad3磷酸化水平,发挥抗肺纤维化作用[13];莪术醇可通过TGF-β1和纤溶酶原激活物抑制剂-1表达,降低羟脯氨酸含量,缓解博来霉素诱导的大鼠肺纤维化[14];党参能抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠核因子κB(NF-κB)及相关炎症介质表达,降低IL-6、IL-1β及IL-8水平[15],并可与活血药配伍,发挥调节细胞外基质代谢、减轻炎症反应等作用,来防治肺纤维化[16];文献报道,虫类药如水蛭、蜈蚣和地龙可减少纤维蛋白沉积及炎症细胞浸润等[17],改善IPF患者的临床症状[18],但关于全蝎治疗IPF的药理作用还有待研究;黄精可显著降低血清IL-6、TNF-α及C反应蛋白含量,减轻肺气虚炎症状态[19];巴戟天可通过促进单核细胞趋化蛋白-1、IL-8蛋白表达,调节免疫,减少机体有害反应[20],但其干预肺纤维化的药理研究目前缺乏文献报道。

本研究采用网络药理学方法筛选得到熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素和山柰酚等为芪术肺纤汤治疗IPF的主要活性成分。研究结果表明,熊果酸可能通过抑制Toll样受体4/NF-κB信号通路激活,抑制下游促炎症细胞因子表达,减轻肺纤维化[21]。芹菜素可降低肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及IL-6等炎症因子含量,改善小鼠肺纤维化病理进程[22];木犀草素可抑制炎症介质IL-1β、TGF-β1表达及NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体活化等,减轻肺部炎症反应及纤维化[23];槲皮素通过抑制大鼠TGF-β1诱导的细胞间质转化和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4-自噬蛋白信号途径,激活自噬并减轻肺纤维化病变[24];山柰酚有抗炎、抗氧化应激等作用,可能与抑制气道和肺实质炎症反应有关[25],同时能显著降低TNF-α、IL-6和IL-1β水平,有效减轻肺组织病理学变化[26]。上述活性成分通过抑制NF-κB信号通路和细胞间质转化,降低IL-6、TNF-α等炎症因子表达等发挥治疗作用,这在PI3K-Akt信号通路中均有所体现。

根据PPI网络分析结果,排序靠前的核心靶点有TP53、Akt1、TNF、1 L-1β、IL-6和VEGFA等,且均与主要活性成分结合良好,证实了芪术肺纤汤治疗IPF的临床疗效。研究结果表明,P53蛋白的激活可诱导肺成纤维细胞衰老,进而加快肺纤维化进展[27];Akt1可调节肺部巨噬细胞中IL-13的表达,减缓肺纤维化发展[28];TNF-α能促进肺组织细胞外间质分泌及胶原纤维过度增殖,造成肺纤维化病理改变[29];IL-6是M1型巨噬细胞分泌的多效因子,可促进纤维化产生,研究结果表明,敲除IL-6基因可明显抑制小鼠TGF-β1表达上调,发挥抗肺纤维化作用[30];VEGF可与血管内皮特异性受体结合,促进细胞增殖和血管新生,而大量无序的新生血管是纤维间隔形成的重要病理过程[31]。

富集分析结果表明,芪术肺纤汤主要影响炎症反应、缺氧反应和基因表达正调控等BP;作用细胞外间隙、细胞膜和细胞质等CC;参与血红素结合、蛋白质结合和转录因子结合等MF;KEGG可能涉及癌症通路、PI3K-Akt信号通路、脂质与动脉粥样硬化、晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化和TNF信号通路等,其中PI3K-Akt信号通路可能通过调控Akt1、TP53、NF-κB、P21和Bcl2等基因,促进糖原合成酶激酶3磷酸化,诱导原癌基因Myc的表达,也可能通过调节下游衰老相关蛋白P21的表达,影响细胞衰老进程,PI3K-Akt通路也将成为下一步深入研究的关注点。分子对接结果表明,熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素与TP53、TNF、Akt1、1 L-1β、IL-6、VEGFA在芪术肺纤汤治疗IPF中发挥重要作用,可为临床研究中药治疗IPF提供思路和方向。

综上所述,本研究采用网络药理学方法和分子对接技术,揭示了芪术肺纤汤多成分、多靶点、多通路治疗IPF的作用机制,可为中医药治疗IPF提供线索和证据支持。但本研究主要是从理论层面探讨,后期还将开展实验研究进一步验证结果的准确性。