补阳还五汤对脑缺血再灌注大鼠线粒体氧化损伤和PKCε-Nampt 通路的影响

尹美娟，刘真一，靳晓飞，周晓红，高 钰，赵月眸，高维娟

（河北中医学院，河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091）

缺血性脑卒中的病理过程常发生脑缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR） 损伤［1］，其机制复杂，氧自由基的过度产生所引发的连锁反应是病情发生发展的核心环节［2］。线粒体是细胞的产能中心，I/R 产生的大量活性氧可使线粒体功能失调，导致细胞代谢障碍，甚至死亡［3-4］。

蛋白激酶Cε（protein kinase C epsilon，PKCε）是PKC 家族的丝氨酸/苏氨酸激酶的同种型，是维持线粒体功能和神经保护的重要信号通路［5］。烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt） 是PKCε 重要下游靶点，通过促进辅酶Ⅰ （nicotinamide adenine dinucleotide，NAD） 的合成、提高辅酶Ⅰ氧化型NAD＋和还原型NADH 比值能保持线粒体的稳态，增强缺血性损伤后的神经元活力。当脑I/R 时，可激活ε减轻线粒体功能损伤［6］。此外，上调Nampt 表达可提高NAD＋/NADH 的比值，减轻线粒体损伤，同时产生抗氧化应激作用［7］。由此可知，PKCε-Nampt 是减轻脑缺血再灌注线粒体损伤的重要通路。

补阳还五汤是治疗气虚血瘀型脑卒中的名方，具有补气活血通络之效［8］。本研究建立SD 大鼠大脑中动脉梗塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO） 模型，探索补阳还五汤减轻线粒体氧化损伤的作用和对PKCε-Nampt 通路的影响。

1 材料

1.1 动物 健康雄性SD 大鼠，体质量230～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京） 2021-0011，实验动物使用许可证号SYXK （冀） 2017-005］，饲养温度、湿度适宜，适应性饲养7 d，自由摄食、饮水。所有实验过程都严格按照NIH 《实验动物的护理和使用指南》 进行，遵守实验动物护理原则，并经动物伦理委员会批准（伦理号DWLL2019025）。

1.2 试剂与药物 补阳还五汤（黄芪120 g，赤芍5 g，当归6 g，红花、桃仁、川芎、地龙各3 g，水煎剂浓缩至100 mL，质量浓度1.43 mg/L） 所用药材均购自北京同仁堂健康药业股份有限公司，其提取制备工艺、质量标准及使用剂量参照前期实验结果［9］。依达拉奉（货号P816062，上海麦克林生化科技股份有限公司）。PKCε抗体（货号sc-1681，美国 Santa Cruz 公司）； p-PKCε 抗体 （货号GTX52352，美国GeneTex 公司）； Nampt 抗体（货号EPR21980，英国Abcam 公司）； MAP-2、βactin 抗体、二抗 （货号GB11128-2、GB15001、GB23301，武汉赛维尔生物科技有限公司）；NAD＋/NADH 检测试剂盒、线粒体膜电位（JC-1）试剂盒（货号S0175、C2003S，上海碧云天生物技术有限公司）； 0.45 μm 聚偏二氟乙烯（ polyvinylidene fluoride，PVDF ） 膜 （ 货 号IPVH00010，美国 Millipore 公司）； 活性氧（ reactive oxygen species，ROS ）、丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 试剂盒（货号E004-1-1、A003-1-2、A001-3-2，南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 仪器 Fusion FX5 Spectra 多功能成像系统（法国Vilber 公司）； 显微镜拍照系统、DM5000B正置荧光显微镜（德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 大鼠局灶性脑I/R 损伤模型制备 采用栓线法，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg） 进行麻醉，仰卧位固定于手术操作台上，消毒，备皮，在颈部正中开口，分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA） 及颈外动脉（external carotid artery，ECA），结扎ECA，用动脉夹夹闭CCA 与ICA，迅速于ECA 与ICA 分叉处作一切口，插入线栓沿颈内动脉到达大脑前动脉起始端，入栓深度20 mm 左右遇阻力停止，2 h 后轻轻拔出线栓，缝合伤口。

2.2 分组及给药 将大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组和依达拉奉组，假手术组仅分离血管，不插线栓，其余各组按“2.1” 项下方法进行造模。术后24 h，补阳还五汤组灌胃补阳还五汤14.3 g/kg［10-11］，依达拉奉组腹腔注射依达拉奉3 mg/kg，假手术组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每隔24 h 给药1 次，连续7 d，进行神经功能评分后处死取材。

2.3 Zea-longa 评分评价神经功能缺陷 按照随机双盲法原则，参照Zea-longa 评分标准进行评价［12-13］，0 分，无神经损伤症状； 1 分，悬尾实验不能完全伸展对侧前爪； 2 分，向对侧转圈； 3 分，向对侧倾倒； 4 分，无自主活动或陷入深度昏迷中，1～3 分为造模成功。除假手术组外，其余各组0、4 分大鼠予以剔除，在后续实验中补充造模成功者以保证每组数量一致。

2.4 TTC 染色检测脑梗死体积百分比 大鼠麻醉后快速取出完整脑组织，冰冻20 min 后切成2 mm冠状切片，浸泡在TTC 染液中，放置在37 ℃恒温箱中避光孵育20 min，每10 min 翻动1 次。完成染色后，4%多聚甲醛固定过夜后拍照。采用Image J 图像分析软件计算大鼠脑梗死体积占总体积的百分比。

2.5 免疫荧光检测神经元标志物微管相关蛋白2（MAP-2） 表达 大鼠麻醉灌流后取出完整脑组织，经固定、石蜡包埋后切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水冲洗，封闭液室温封闭1 h，滴加一抗MAP-2 （1 ∶200） 4 ℃孵育过夜，洗涤后用Cy3 标记的山羊抗兔IgG 荧光抗体（1 ∶500） 室温孵育1 h，洗涤后用含DAPI 的抗荧光淬灭剂封片。通过荧光显微镜分别采集大鼠脑组织皮质缺血半暗带区域DAPI、MAP-2 图像，将2 种荧光图像融合，分析MAP-2 荧光强度，采用Image J 软件分析并计算平均光密度以评价神经元损伤情况。

2.6 脑组织氧化应激水平检测 大鼠麻醉后快速剥离出大脑皮层组织，置于PBS 缓冲液中匀浆，12 000×g离心20 min，按照各试剂盒说明书检测组织上清液中ROS、MDA 水平和SOD 活性。

2.7 脑组织线粒体膜电位检测 大鼠麻醉后快速剥离大脑皮层组织，采用线粒体分离试剂分离线粒体，加入JC-1 染色液进行染色，在激发波长490 nm、发射波长530 nm 下检测JC-1 单体，在激发波长525 nm、发射波长590 nm 下检测JC-1 聚集体，通过JC-1 聚集体与单体的相对比值表示线粒体膜电位。

2.8 修饰酶循环法检测脑组织NAD＋/NADH比值 大鼠麻醉后快速剥离出大脑皮层半暗带组织，根据试剂盒说明书分别提取NAD＋和NADH，采用荧光酶标仪测定其吸光度，计算两者比值。

2.9 Western blot 检测PKCε-Nampt 信号通路蛋白表达 大鼠麻醉后快速剥离出大脑皮层半暗带组织，加入裂解液研磨破碎，沉降、振荡、离心后采用BCA 法测定蛋白含量。蛋白经99 ℃加热变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转法转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，一抗PKCε（1 ∶500）、p-PKCε（1 ∶1 000） 和Nampt （1 ∶1 000） 4 ℃孵育过夜，洗膜后加二抗室温孵育1 h，显影，成像，以β-actin 为内参，采用Image J 软件进行分析。

2.10 免疫组化检测p-PKCε和Nampt 蛋白表达大鼠麻醉灌流后取出完整脑组织，经固定、包埋后切片，浸泡在柠檬酸抗原修复缓冲液中，微波炉加热20 min 进行抗原修复，室温冷却后用PBS 洗涤，加双氧水消除内源性过氧化物酶，3% BSA 室温封闭1 h，一抗p-PKCε（1 ∶200） 和Nampt （1 ∶200） 4 ℃孵育过夜，PBS 洗涤后用辣根过氧化物酶（HRP） 标记的山羊抗兔IgG （1 ∶500） 室温孵育1 h，PBS 洗涤后滴加DAB 显色液，于显微镜下观察到棕黄色阳性表达时ddH2O 洗涤，苏木素复染细胞核，脱水，透明，中性树胶封片，在显微镜下观察大鼠脑组织皮质缺血半暗带区域并采集图片，采用Image J 软件分析并计算平均光密度以评价蛋白表达。

2.11 统计学分析 通过SPSS 20.0、GraphPad Prism 5.01 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 补阳还五汤对MCAO 大鼠神经功能评分的影响 如图1 所示，假手术组无神经功能损伤，评分为0； 与假手术组比较，模型组Zea-longa 评分升高（P＜0.05）； 与模型组比较，补阳还五汤组和依达拉奉组Zea-longa 评分降低（P＜0.05），并且前者低于后者（P＜0.05）。

图1 补阳还五汤对MCAO 大鼠神经功能评分的影响（±s，n＝6）Fig.1 Effects of Buyang Huanwu Decoction on neurological function score of MCAO rat models （±s，n＝6）

3.2 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑梗死体积的影响 如图2 所示，红色为无损伤脑组织，白色为脑梗死组织； 假手术组未见白色梗死区； 与假手术组比较，模型组脑组织可见明显白色梗死区，脑梗死体积百分比升高（P＜0.05）； 与模型组比较，补阳还五汤组和依达拉奉组脑组织梗死体积百分比降低（P＜0.05），并且前者低于后者（P＜0.05）。

图2 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑梗死体积的影响（±s，n＝3）Fig.2 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral infarction volume in MCAO rat models （±s，n＝3）

3.3 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑组织MAP-2 表达的影响 MAP-2 是组成神经元细胞骨架的重要组成成分，存在于神经元的胞体、树突中，可作为神经元的标志物［14］，通过免疫荧光观察MAP-2 在I/R 前后的表达变化情况，以此判定神经细胞的损伤程度。如图3 所示，与假手术组比较，模型组MAP-2 荧光强度减弱（P＜0.05）； 与模型组比较，补阳还五汤组和依达拉奉组MAP-2 荧光强度增强（P＜0.05），并且前者高于后者（P＜0.05）。

图3 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑组织MAP-2 表达的影响（×400，±s，n＝3）Fig.3 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral MAP-2 expression of MCAO rat models （×400，±s，n＝3）

3.4 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑组织线粒体膜电位的影响 如图4 所示，与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧大脑皮质线粒体膜电位降低（P＜0.05），提示线粒体去极化； 与模型组比较，补阳还五汤组和依达拉奉组可逆转该现象，其线粒体膜电位升高（P＜0.05），2 组比较无明显差异（P＞0.05）。

图4 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑组织线粒体膜电位的影响（±s，n＝3）Fig.4 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral mitochondrial membrane potential of MCAO rat models （±s，n＝3）

3.5 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑组织氧化应激水平的影响 如图5 所示，与假手术组比较，模型组ROS、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）； 与模型组比较，补阳还五汤组和依达拉奉组ROS、MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05），2 组氧化应激水平比较无明显差异（P＞0.05）。

图5 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑组织氧化应激水平的影响（±s，n＝3）Fig.5 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral oxidative stress of MCAO rat models （±s，n＝3）

3.6 补阳还五汤对MCAO 大鼠PKCε、p-PKCε、Nampt 蛋白表达的影响 如图6 所示，与假手术组比较，模型组PKCε、Nampt 蛋白表达降低（P＜0.05），p-PKCε蛋白表达升高（P＜0.05）； 与模型组比较，补阳还五汤组和依达拉奉组PKCε、p-PKCε、Nampt 蛋白表达升高（P＜0.05），并且前者p-PKCε、Nampt 蛋白表达高于后者（P＜0.05），2 组PKCε蛋白表达比较无明显差异（P＞0.05）。

图6 补阳还五汤对MCAO 大鼠PKC ε、p-PKC ε和Nampt 蛋白表达的影响（±s，n＝3）Fig.6 Effects of Buyang Huanwu Decoction on protein expressions of PKCε，p-PKCεand Nampt in MCAO rat models （±s，n＝3）

3.7 补阳还五汤对MCAO 大鼠p-PKCε、Nampt 蛋白阳性表达的影响 如图7 ～8 所示，与假手术组比较，模型组p-PKCε 阳性表达升高（P＜0.05），Nampt 阳性表达降低（P＜0.05）； 与模型组比较，补阳还五汤组和依达拉奉组p-PKCε、Nampt 阳性表达升高 （P＜0.05），补阳还五汤组p-PKCε、Nampt 蛋白阳性表达高于依达拉奉组（P＜0.05）。

图7 补阳还五汤对MCAO 大鼠p-PKC ε表达的影响（±s，n＝3）Fig.7 Effects of Buyang Huanwu Decoction on expression of p-PKC εin MCAO rat models （±s，n＝3）

图8 补阳还五汤对MCAO 大鼠Nampt 表达的影响（±s，n＝3）Fig.8 Effects of Buyang Huanwu Decoction on expression of Nampt in MCAO rat models （±s，n＝3）

3.8 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑组织NAD＋/NADH 比值的影响 如图9 所示，与假手术组比较，模型组NAD＋/NADH 比值降低（P＜0.05）； 与模型组比较，补阳还五汤组和依达拉奉组NAD＋/NADH 比值升高（P＜0.05），2 组比较无明显差异（P＞0.05）。

图9 补阳还五汤对MCAO 大鼠脑组织NAD＋/NADH 比值的影响（±s，n＝3）Fig.9 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral NAD＋/NADH ratio of MCAO rat models （±s，n＝3）

4 讨论

脑I/R 损伤是急性缺血性脑卒中血流再通后发生的继发性损伤，再引发多种级联反应，而ROS大量产生是其主要病理环节。线粒体是ROS 主要产生场所，ROS 的大量生成可损伤线粒体，导致线粒体功能异常，而线粒体功能异常又会进一步促进ROS 生成，加重氧化应激，可见氧化应激损伤是导致I/R 后线粒体损伤的关键［15］。另外，ROS能破坏线粒体膜结构，造成线粒体损伤，最终导致细胞死亡。脂质是生物膜的重要组成［16］，脂质损伤生成的MDA 可以在一定程度上体现ROS 对线粒体膜损伤的程度。SOD 是体内重要的抗氧化酶，线粒体所产生的ROS 主要由位于线粒体内的Mn-SOD 清除，SOD 活性可以体现线粒体的抗氧化能力。过度氧化应激损伤线粒体功能，导致线粒体膜电位下降，造成脑I/R 损伤。

PKCε是影响神经细胞生存和功能恢复，调节线粒体功能的重要靶点。当细胞能量充足时，PKCε处于失活状态，当脑I/R 损伤时，PKCε从胞浆向质膜移位，激活了PKCε的Ser-729 磷酸化位点，从而细胞中p-PKCε 增多［17］。NAD 是细胞内重要的调节因子，主要有2 种形式，即NAD＋和NADH。在氧化还原反应中NAD＋/NADH 比例的相对稳定可维持线粒体功能。Nampt 是生产NAD 的酶，对线粒体和神经功能起保护作用［18］。Nampt表达的增加会提高NAD＋水平和NAD＋/NADH 比例［19］。PKCε是Nampt 上游的重要蛋白，缺血时NAD＋消耗过多，PKCε 可介导线粒体NAD＋生成，维持线粒体DNA 完整性，减轻缺血性损伤［20］。由此可知，PKCε-Nampt 可通过提高线粒体NAD＋/NADH 比例来保护神经功能。

中医学认为，缺血性脑卒中基本病机是气虚血瘀、脑脉阻滞［21］。益气活血能改善气血运行，使上达脑窍气血充足，从而发挥脑保护作用［22］。补阳还五汤能益气活血，是治疗气虚血瘀型脑卒中的经典方剂，全方重用黄芪补气，配伍活血化瘀药，共奏补气活血通络之效［23］。线粒体是细胞进行氧化反应和为细胞提供能量的主要场所，而中医中“元气” 具有调控全身气血的功能，两者均具有推动、激发生理活动的功能，恢复线粒体功能正体现补阳还五汤的补气活血功效。依达拉奉是一种自由基清除剂，是临床上治疗缺血性脑卒中的常用药，而氧自由基与线粒体损伤息息相关，故选择依达拉奉为阳性对照药［24］。本研究通过建立大鼠MCAO模型，以脑缺血2 h 再灌注7 d 模拟缺血性脑卒中损伤［25］，给予补阳还五汤干预，发现该方可改善神经功能缺陷，减少脑梗死体积，提高MAP-2 表达，降低ROS 及MDA 水平，提高SOD 活性，减轻氧化应激损伤，恢复线粒体膜电位。进一步研究发现，补阳还五汤可提高PKCε、p-PKCε和Nampt蛋白表达，提高脑组织NAD＋/NADH 比值。以上结果表明，补阳还五汤可以恢复线粒体功能降低氧化应激，减轻脑缺血再灌注损伤，其作用可能与激活PKCε-Nampt 通路有关。