HPLC 法同时测定益肾泄浊合剂中5 种成分的含量

冯子芳，袁晓航，陈晓伟，胡敏敏，张文明，顾丽红，杨庆有，2，卞振华*

（1.南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡 214074； 2.无锡转化医学中心，江苏 无锡 214000）

目前，慢性肾脏病对人类健康造成严重危害，患病率达10% ～12%，容易与心血管疾病合并而导致高致残率、高病死率、预后不良等，是全球公共卫生的重要议题［1-2］。益肾泄浊合剂（苏药制备字Z20220028000） 是无锡市中医医院的院内制剂，由黄芪、酒萸肉、紫苏叶、法半夏、黄连、薏苡仁、熟大黄、燀桃仁、积雪草组成，肾内科以健脾益肾、化瘀泄浊为指导，根据治病宜谨守病机的原则创立本方，针对早中期慢性肾脏病疗效较好［3］。环烯醚萜苷类（莫诺苷、马钱苷等）、有机酸 （没食子酸） 及其酯类［4］为其君药山茱萸的主要活性成分，其中莫诺苷和马钱苷不仅含量最高，而且是特征性成分［5］，没食子酸还具有抗氧化、抗癌等作用［6］； 大黄中的蒽醌类是一种具有抗炎、保护心血管等作用的重要活性成分，包括大黄酸、大黄酚等［7］。

前期已有对于其临床疗效及提取工艺的研究［8-9］，未见质量标准的研究报道，本研究参考前期报道，建立HPLC法测定益肾泄浊合剂中含量高、易提取的君药黄芪（毛蕊异黄酮苷）、山茱萸（莫诺苷、马钱苷、没食子酸）、佐药大黄（大黄酸） 的含量，为制剂质量的整体控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪、DAD 二极管阵列检测器（美国Agilent 公司）； DHG-9101-0SA 电热恒温鼓风干燥箱（常州普天仪器制造有限公司）； BSA224S-CW 电子天平（德国Sartorius 公司）； KQ-500DE 数控超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 没食子酸（批号C13O9C72105，纯度≥98%）、莫诺苷（批号Z12O8B45504，纯度≥97%）、马钱苷（批号P22F10F81444，纯度≥98%）、毛蕊异黄酮苷（批号 J19HB174062，纯度≥98%）、大黄酸 （ 批号T06J10F92311，纯度≥98%） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司）； 其他试剂均为分析纯； 水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

中药饮片均来源于苏州市天灵中药饮片有限公司，经无锡市中医医院副主任中药师王卿鉴定为正品，具体见表1。

表1 中药饮片信息

益肾泄浊合剂（每1 mL 相当于饮片1.18 g） 由无锡市中医医院制剂室制备（制备工艺［9］为加12 倍量水浸泡30 min，煎煮2 次，每次1.5 h），共10 批（S1 ～S10），批号20221201～20221210。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 参考前期报道，Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～10 min，2% ～4%B； 10 ～15 min，4% ～6% B； 15 ～20 min，6% ～7% B； 20 ～22 min，7% ～10%B； 22 ～32 min，10% B； 32 ～40 min，10% ～13%B； 40～50 min，13%B； 50 ～90 min，13% ～52% B； 90～95 min，52% B； 95 ～100 min，52% ～2% B）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长254 nm； 进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，加入70%甲醇制成每1 mL 分别含没食子酸99.20 μg、莫诺苷154.40 μg、马钱苷97.60 μg、毛蕊异黄酮苷39.20 μg、大黄酸49.60 μg 的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密吸取益肾泄浊合剂1.5 mL，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇超声（40 kHz、100 W） 处理10 min，冷却至室温，稀释至刻度，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 参考文献［10］ 报道，根据处方工艺［9］，按“2.2.2” 项下方法分别制备缺山茱萸、缺黄芪、缺大黄的阴性样品，即得。

2.3 方法学考察 参考文献［11］ 报道。

2.3.1 专属性考察 分别取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，可见色谱峰分离度较好，阴性无干扰，缺山茱萸阴性样品溶液中无没食子酸、莫诺苷、马钱苷峰，缺黄芪阴性样品溶液中无毛蕊异黄酮苷峰，缺大黄阴性样品溶液中无大黄酸峰，表明该方法专属性良好，色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.3.2 线性关系考察 参考文献［12］ 报道，精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，70%甲醇稀释成不同质量浓度，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度（X） 为横坐标，峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，稀释5 倍，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、莫诺苷、马钱苷、毛蕊异黄酮苷、大黄酸峰面积RSD 分别为0.16%、0.70%、0.16%、0.11%、0.07%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 精密量取益肾泄浊合剂（批号20221205，S5） 6 份，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、莫诺苷、马钱苷、毛蕊异黄酮苷、大黄酸峰面积RSD分别为1.81%、1.00%、0.98%、1.00%、1.01%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 精密量取同一份益肾泄浊合剂（批号20221205，S5），于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、莫诺苷、马钱苷、毛蕊异黄酮苷、大黄酸峰面积RSD 分别为1.43%、0.31%、0.42%、0.52%、0.52%，表明溶液24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 参考文献［13］ 报道，精密量取各成分含量已知的益肾泄浊合剂（S5） 0.75 mL，共6 份，置于10 mL 量瓶中，精密加入含没食子酸130.10 μg/mL、莫诺苷422.00 μg/mL、马钱苷160.30 μg/mL、毛蕊异黄酮苷40.20 μg/mL、大黄酸65.30 μg/mL 的对照品溶液1 mL，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。结果，没食子酸、莫诺苷、马钱苷、毛蕊异黄酮苷、大黄酸平均加样回收率分别为102.15%、103.82%、100.30%、97.76%、97.97%，RSD 分别为2.70%、2.64%、2.83%、2.59%、2.58%。

2.3.7 样品含量测定 按“2.2.2” 项下方法制备10 批益肾泄浊合剂的供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（μg/mL）

3 讨论

3.1 指标成分选择 本方以黄芪、山茱萸为君药，2020年版《中国药典》 将毛蕊异黄酮苷作为黄芪质量控制成分［14］，专属性强，疗效确切。山茱萸中含量最高的一类化合物是环烯醚类，这些化合物大多与糖分子结合成环烯醚萜苷［15］，其主要成分莫诺苷和马钱苷含量高达85%，是主要的有效成分，在糖尿病、肾病、炎症的治疗上效果较好，同时也是2020 年版《中国药典》 中山茱萸的质量控制成分［14，16-18］。现代研究表明，山茱萸含有的有机酸及其酯类成分，对肾虚、月经过多气血虚弱等患者疗效较好［19-20］。大黄为佐药，吴新程［21］研究表明，大黄酸的抗纤维化作用是通过调节TGF-β1/Smad 信号通路来实现的。钟瑜萍等［22］研究发现，大黄-黄芪配伍可减轻慢性肾衰大鼠蛋白尿的临床症状，减少肾脏的病理损害，从而保护肾脏功能，提高肾小球滤过率。

3.2 色谱柱选择 通过查阅文献［23-24］，采用不同色谱柱（Agilent Eclipse XDB-C18、YMC-Pack ODS-AC18、Waters XBridge C18） 测定各成分含量，发现均能较好地分离，无显著差异，表明该方法适用性较好。

3.3 流动相选择 考察不同流动相对色谱峰分离的影响，采用甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸进行梯度洗脱，发现乙腈的洗脱效果优于甲醇，加入一定量的磷酸可以改善峰形，因此选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。

3.4 柱温选择 对色谱峰在不同柱温（25、30、35 ℃）下的出峰情况进行考察，发现柱温降低，色谱峰保留时间延后，相反则提前出峰； 为25 ℃时，各成分出峰时间明显延后，洗脱时间较长，分离效率较低； 为35 ℃时，没食子酸保留时间在5 min 内，与溶剂峰重合，最终确定为30 ℃。

3.5 检测波长选择 对没食子酸、莫诺苷、马钱苷、毛蕊异黄酮苷和大黄酸进行全波长扫描，最终确定为254 nm，此时益肾泄浊合剂中各成分紫外吸收较好，杂质干扰较小。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定益肾泄浊合剂中5 种成分（没食子酸、莫诺苷、马钱苷、毛蕊异黄酮苷和大黄酸） 的含量，该方法准确、可靠、重复性好，可为该方质量评价和控制提供依据。