六神曲多糖提取工艺优化及其抗溃疡性结肠炎作用研究

栗嘉淇，尹 磊，郑 威，宋孟霜，张 希，孔 兵，许 枬*

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600； 2.安徽普仁中药饮片有限公司，安徽 亳州 236800）

六神曲作为常用健脾中药，是神曲消食口服液、小儿至宝丸等制剂的主要组成，虽然其活性物质与作用机理目前尚不明确，但一些研究已证实六神曲具有良好的肠道保护作用［1-3］。前期报道，以六神曲为食物添加剂时，可缓解仔猪断乳应激，改善肠道菌群，提高肠内容物中短链脂肪酸含量与血浆抗氧化能力，降低肠黏膜炎症因子水平，而且副作用比抗生素更小［4］； 可通过减少结肠黏膜中致病性鞭毛细菌及其鞭毛蛋白含量，抑制特异性受体TLR5 蛋白表达，减少内脏过敏［5］，还具有抑制LPS 诱导RAW 264.7细胞产生NO、TNF-α 等炎症因子分泌作用［6］。

成分研究显示，六神曲活性与发酵有关［7-8］。Fu［9］等发现，在发酵第7 天六神曲成分与原料成分的相似度仅为0.106，苦杏仁苷、芦丁等成分被降解，提示发酵是其产生活性物质的重要过程。课题组前期研究发现，六神曲发酵前后多糖类成分发生显著变化，其中水溶性多糖含量增加20%以上［10］。为了揭示六神曲多糖活性，本实验优化该成分提取工艺，并采用DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠模型探索其肠道保护作用。

1 材料

1.1 仪器 Fresco 台式冷冻离心机，购自德国Heraeus 公司； BDplus6 流式细胞仪，购自美国BD Biosciences 公司；Milli-Q IQ 7000 纯水仪，购自德国默克公司； U-3010 紫外-可见分光光度计，购自日本日立公司； 电子天平（十万分之一），购自德国赛多利斯公司； DHG-9053A 电热恒温鼓风干燥箱，购自上海申贤恒温设备厂； HH-4 数显恒温水浴锅，购自常州国华电器有限公司； UX4200S 电子天平，购自上海衡发实业有限公司； ECLIPSE Ts2-FL 倒置生物显微镜，购自日本Nikon 公司。

1.2 试剂与药物 蒽酮、联邻甲苯胺（上海阿拉丁生化材料股份有限公司，批号K2202111、T818491）； 葡聚糖硫酸钠（美国MP Biomedicals 公司，批号S7102）。柳氮磺吡啶肠溶片（上海信谊天平药业有限公司，批号09220302）。APC Rat Anti-mice CD4、PE Rat Anti-mice CD8a、PE Rat Anti-mice Foxp3、4×Fix/Perm Buffer、Diluent Buffer、5×Perm/Wash Buffer （美国BD 公司，批号553051、553030、563101、562574、562574、562574）； 1×PBS （索莱宝生物科技有限公司，批号20210927）。红细胞裂解液 ［批号abs9101，爱必信（上海） 生物科技有限公司］。六神曲、面粉、苦杏仁、赤小豆、辣蓼、青蒿、苍耳草、麦麸（安徽普仁中药饮片有限公司，批号2112052），经安徽普仁饮片有限公司尹磊工程师鉴定为正品，标本保存于安徽普仁饮片有限公司。无水葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、乙醚（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.3 动物 SPF 级健康雄性C57BL/6 小鼠，6～8 周龄，体质量18～22 g，购自辽宁长生生物科技股份有限公司，动物生产许可证号SCXK （辽） 2020-0001，饲养于辽宁中医药大学大连校区实验动物中心SPF 级动物房。动物实验经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批件号2020041）。

2 方法与结果

2.1 多糖含量测定

2.1.1 供试品溶液制备 精密称取六神曲粉末0.5 g，置于圆底烧瓶中，加80%乙醇20 mL，加热回流提取2 h，趁热过滤，弃滤液，药渣加50 mL 水，加热回流提取2 h，趁热过滤，精密吸取续滤液3 mL，置于50 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品25 mg，置于100 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 最大吸收波长确定 精密吸取供试品溶液1 mL、对照品溶液0.5 mL，置于10 mL 具塞刻度试管中，加水至1.0 mL，摇匀，缓慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液5 mL，摇匀，迅速置于沸水浴中加热10 min，取出，立即置于冰水浴中冷却10 min，取出，以相应试剂为空白，在400～800 nm 波长范围内扫描吸收曲线。最终确定，最大吸收波长为638 nm。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，各3 份，按“2.1.3” 项下方法处理，在638 nm 波长处测定吸光度。以对照品进样量为横坐标（X），吸光度为纵坐标 （A） 进行回归，得方程为A＝5.834 3X-0.015 7 （r＝0.999 15），在0.025 4～0.127 0 mg范围内线性关系良好。

2.1.5 多糖得率测定 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，精密量取1 mL，平行3 份，置于10 mL 具塞刻度试管中，按“2.1.3” 项下方法处理，在638 nm 波长处测定吸光度，计算多糖得率，，其中C为多糖含量，V为供试品溶液体积，N为稀释倍数，M为六神曲粉末质量。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 精密量取供试品溶液1.0 mL，置于10 mL 具塞试管中，按“2.1.3” 项下方法处理，在638 nm波长处测定吸光度6 次，测得其RSD 为0.32%，表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验 按“2.1.1” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别精密量取1.0 mL，置于10 mL 具塞试管中，按“2.1.3” 项下方法处理，在638 nm 波长处测定吸光度，测得多糖含量RSD 为1.84%，表明该方法重复性良好。

2.2.3 稳定性试验 精密量取供试品溶液1 mL，置于10 mL 具塞试管中，按“2.1.3” 项下方法处理，于2、4、8、12、24 h 在638 nm 波长处测定吸光度，测得多糖含量RSD为1.26%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.4 加样回收率试验 精密量取9 份多糖含量已知的六神曲粉末，加入一定量对照品，按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，分别精密量取1 mL，置于10 mL 具塞试管中，按“2.1.3” 项下方法处理，在638 nm 波长处测定吸光度，计算回收率。结果，平均加样回收率为98.29%，RSD 为1.54%。

2.3 提取工艺优化 采用Box-Behnken 响应面法。根据预实验结果，确定初始提取工艺为六神曲细粉加一定体积分数乙醇提取，弃取醇提液，药渣加水煎煮，过滤，取上清液，加入乙醇充分搅拌，使含醇量达80%，室温静置24 h，离心，收集沉淀，冷冻干燥。

在单因素试验基础上，以乙醇体积分数（A）、醇提时间（B）、液料比（C）、水提时间（D） 为影响因素，多糖得率（Y） 为评价指标，优化提取工艺，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

通过Design-Expert 13.0 软件对表2 数据进行拟合，得方程为Y＝18.22-1.53A＋0.096 7B＋1.54C＋0.985 0D-0.982 5AB＋0.427 5AC＋1.93AD-0.992 5BC＋0.385 0BD＋1.08CD-2.23A2-2.26B2-2.26C2-2.21D2，方差分析见表3，可行性研究结果见表4。

表3 方差分析结果

表4 可行性研究结果

由表3 可知，模型P＜0.01，具有高度显著性； 失拟项P＞0.05，表明未知因素对实验结果影响较小； 各因素及其交互项、二次项均有显著或极显著影响（P＜0.05，P＜0.01）。由表4 可知，决定系数R2、调整决定系数AdjR2均大于0.95，表明模型拟合度较高，可替代真实点进行分析优化。

响应面分析见图1。由此可知，各因素对多糖得率的影响均呈抛物线形；AC、AD、BC、BD交互的等高线中心呈椭圆形，表明上述两两因素交互作用有显著影响； 各因素影响程度依次为C＞A＞D＞B。

图1 各因素响应面图

最终确定，最优提取工艺为乙醇体积分数77.878%，醇提时间2.003 h，液料比43.729 ∶1，水提时间2.111 h，多糖得率为18.774%，为了便于实验操作，将其修正为乙醇体积分数78%，醇提时间2 h，液料比44 ∶1，水提时间2 h。按上述优化工艺进行3 批验证试验，测得多糖得率分别为18.424%、18.826%、18.121%，平均值为18.457%，与预测值18.774%接近，表明模型稳定性良好，并且所得提取液经冷冻干燥后为白色粉末。

2.4 抗溃疡性结肠炎作用研究

2.4.1 药液制备

2.4.1.1 多糖 取按“2.3” 项下优化工艺制备的多糖适量，加水制成0.18 g/mL 溶液，即得（含六神曲生药量为1 g/mL）。

2.4.1.2 阳性药 取柳氮磺胺吡啶肠溶片适量，研成细粉，加水制成混悬液（40 mg/mL），即得。

2.4.1.3 模型 称取DSS 适量，加蒸馏水制成浓度为2%，振摇，溶解，即得。

2.4.2 分组、造模与给药 60 只小鼠适应性饲养1 周后，随机分为空白组、模型组、阳性药组（400 mg/kg）、六神曲多糖组（1.8 g/kg，折合临床剂量的6 倍），每组15 只，通过自由饮用“2.4.1.3” 项下药液来制备慢性溃疡性结肠炎模型。空白组小鼠全程饮用蒸馏水，其余各组小鼠前5 d 饮用含2% DSS 的蒸馏水，第6 ～10 天改饮蒸馏水，每10 d 为1 个周期，在第3 个周期的第7 天实验结束。实验期间，阳性药组、六神曲多糖组小鼠每天分别灌胃给予相应剂量药物，空白组、模型组小鼠灌胃给予等体积蒸馏水。末次给药后，小鼠禁食12 h，麻醉处死，采集组织样本，记录结肠长度，检测相应生化指标。采用SPSS 25.0 软件对数据进行统计，结果以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA） 结合t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义，并采用GraphPad Prism 8.0 软件绘图。

2.4.3 体质量、疾病活动指数（DAI） 评分 每天记录各组小鼠体质量、粪便性状，每2 d 分析1 次粪便隐血情况［11］，计算DAI 评分［12］，公式为DAI 评分＝ （体质量变化评分＋粪便性状评分＋便血评分）/3，其中体质量变化率＝［（测定时体质量-初始体质量） /初始体质量］ ×100%，标准见表5。

表5 DAI 评分标准

造模第4 天开始，模型组小鼠粪便开始出现隐血，第7 天时开始出现肉眼血便； 造模7 d 后，阳性药组、六神曲多糖组小鼠粪便才开始出现粪便隐血。图2A 显示，实验结束时空白组小鼠体质量平均增加17.97%； 模型组小鼠体质量平均下降18.24%； 阳性药组、六神曲多糖组小鼠体质量变化趋势基本一致，并且其下降率均低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。图2B 显示，与空白组比较，模型组小鼠DAI 评分升高（P＜0.01）； 与模型组比较，六神曲多糖组小鼠DAI 评分降低（P＜0.01）。

图2 各组小鼠体质量、DAI 评分比较

2.4.4 结肠组织形态学 各组小鼠麻醉处死后剪开腹腔，分离结肠，测定长度，再剪取1 cm 左右远端结肠，PBS 缓冲液冲洗后用4%多聚甲醛固定，30%蔗糖溶液脱水，OCT包埋（-80 ℃），切片，HE 染色，显微镜下观察组织形态，结果见图3A。由此可知，空白组小鼠结肠黏膜完整，腺体结构排列规则，上皮细胞排列紧密，杯状细胞丰富，无炎症细胞浸润； 模型组小鼠结肠组织结构紊乱，结肠黏膜严重损伤，隐窝与杯状细胞大量消失，伴有大量炎症细胞浸润； 六神曲多糖组、阳性药组小鼠结肠黏膜受损较轻，腺体排列基本规则，杯状细胞较多，炎症细胞浸润较少。

图3 各组小鼠结肠组织病理变化及结肠长度（HE×100）

结肠长度见图3B、表6。由此可知，与空白组比较，模型组小鼠结肠长度缩短（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组、六神曲多糖组小鼠结肠长度增长（P＜0.05，P＜0.01），以后者更明显。

表6 各组小鼠结肠长度比较（±s，n＝15）

表6 各组小鼠结肠长度比较（±s，n＝15）

注： 与空白组比较，＃＃P ＜0.01； 与模型组比较，*P ＜0.05，**P＜0.01。

组别结肠长度/cm空白组7.30±0.15模型组4.97±0.49＃＃阳性药组5.90±0.49＃＃*六神曲多糖组6.67±0.59**

2.4.5 脾脏CD4＋/CD8＋、CD4＋Foxp3＋Treg 水平 采用机械研磨法将小鼠脾脏制成脾细胞悬液，经离心、重悬、加入Ficoll 试液分层后取淋巴细胞，过细胞筛，计数，抗体孵育、洗涤，加入核内荧光抗体，涡旋，在4 ℃下孵育40 min，PBS 缓冲液洗涤，过筛后采用flowjo 软件（10.0 版本） 上机检测，结果见图4。由此可知，与空白组比较，模型组小鼠脾脏CD4＋/CD8＋、CD4＋Fopx3＋Treg 水平降低（P＜0.01）； 与模型组比较，六神曲多糖组小鼠脾脏两者升高（P＜0.01），但阳性药组无明显变化（P＞0.05）。

图4 各组小鼠脾脏CD4＋/CD8＋、CD4＋Foxp3＋Treg 水平比较

3 讨论

在六神曲传统发酵过程中，有细菌、曲霉、酵母菌等多种微生物参与［13］，除主料面粉中的淀粉经淀粉酶、纤维素酶降解产生次生多糖外［14］，麦麸中阿魏酰阿拉伯木聚糖［15］、酵母细胞壁中甘露聚糖均是六神曲多糖来源［16］，可能是六神曲中多糖含量较高的主要原因，但鲜有关于该成分活性及其结构的报道。本实验在单因素试验基础上，采用Box-Behnken 响应面法优化六神曲多糖提取工艺，测得其得率为18.457%，与预测值18.774% 接近，表明工艺准确可靠，可为后续该成分活性、构效关系研究奠定基础。

多糖类成分不能被肠道直接吸收，往往是被结肠内微生物降解，产生短链脂肪酸或通过抗原提呈来参与T 细胞免疫调节［17］，从而改善肠道菌群，提高肠道免疫［18］，改善肠道健康。本实验发现，六神曲多糖能有效抑制溃疡性结肠炎小鼠结肠变短、体质量降低、疾病指数增加，提示该成分具有一定的保护肠道作用。

CD4 为T 辅助细胞，CD8 为T 杀伤细胞，两者相互平衡从而发挥维护肠道正常免疫功能［19］。溃疡性结肠炎属于免疫性疾病，患者结肠黏膜T 淋巴细胞亚群变化以CD8＋细胞水平升高、CD4＋/CD8＋下降为主［20］，同时Treg 细胞数降低［21］。本实验发现，慢性结肠炎小鼠给予六神曲多糖后CD4＋/CD8＋升高，接近空白组； Treg 细胞核内转录因子Foxp3＋水平升高，表明其数量出现回调，提示该成分对溃疡性结肠炎的抑制作用可能与调节肠道免疫有关。