基于网络药理学和动物实验探讨黄芪建中汤对脾胃虚寒型功能性消化不良的作用

曾格格，刘天琪，戴全武，黄振阳，何嘉伟，刘 毅

（湖北中医药大学药学院，湖北省药用植物研发中心，湖北 武汉 430065）

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD） 是临床上最常见的胃肠道疾病之一，流行病学调查显示，FD 全球发病率约10% ～30%，我国约18% ～25%，且多发于女性［1-2］。FD 具体发病机制尚未明确，可能与胃肠运动障碍、内脏高敏感性、“脑-肠肽” 分泌异常、心理疾病或感染幽门螺杆菌等有关［3］。中医将FD 归属于“痞满” “胃脘痛” 范畴，病位在胃，与脾、肝相关，以脾虚气滞，胃失和降为基本病机，关键发病机制是脾胃虚弱［4］。黄芪建中汤最早记载于《金匮要略》，是中医临床用于建中补虚、益气固本的代表方［5］。其中，黄芪为君药，健脾益气； 桂枝、生姜为臣药，温阳散寒； 饴糖补脾缓急； 白芍缓急止痛； 大枣、甘草补益脾气，共为佐使药［6］。现黄芪建中汤已广泛应用于治疗脾虚或以脾虚为主要证型的各类消化系统疾病［7-9］。目前对于黄芪建中汤治疗FD 的研究多集中在疗效观察、临床应用，而对此方剂中各味中药共同作用机制及网络化协同作用尚不明确。因此，本研究拟采用网络药理学探索黄芪建中汤干预脾胃虚寒型FD 的成分、靶点及信号通路，结合体内实验深入探究黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 的治疗作用及作用机制，以期为黄芪建中汤临床运用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级10 周龄昆明种雌性小鼠48 只，体质量30～40 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （辽） 2020-0001］，饲养于湖北中医药大学SPF 级实验动物房［实验动物使用许可证号SYXK（鄂） 2017-0067］，室温（25±3）℃，相对湿度40% ～55%，12 h/12 h 光照/黑暗交替，给予标准饲料喂养，自由进食、进水，适应性饲养7 d。本实验符合实验动物福利与伦理委员会要求（伦理号HLK-20221115-001）。

1.2 药物 参考《方剂学》［10］，黄芪建中汤由黄芪5 g（批号220402）、桂枝9 g （批号210621）、白芍18 g （批号220903）、甘草6 g （批号220203）、生姜9 g （批号211209）、大枣12 g （批号220522）、饴糖30 g （批号220910） 组成，饮片均购于湖北中医药大学附属医院中药房，经湖北中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品，符合2020年版《中国药典》 规定，每剂含89 g 生药，常规煎煮浓缩至1 g/mL； 大黄（批号220614） 常规煎煮浓缩至1 g/mL。枸橼酸莫沙必利分散片（亚宝药业集团股份有限公司，批号211112）。

1.3 试剂L-精氨酸（大连美仑生物技术有限公司，货号MB2140）； 碘乙酰胺（北京兰杰柯科技有限公司，批号21167408）； 蔗糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20220505）。小鼠白细胞介素-6 （IL-6）、5-羟色胺（5-HT） ELISA 试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司，货号MU30044、MU30036）； 小鼠胃泌素（GAS） ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号E-ELM2669c）； 小鼠胃动素（MTL） 试剂盒（江苏酶免实业有限公司，货号MM-0211R2）； 苏木素染液、伊红染液（武汉谷歌生物科技有限公司）； GAPDH 抗体、蛋白激酶B（Akt） 抗体、磷酸化蛋白酶B （p-Akt） 抗体、山羊抗鼠和抗兔IgG 二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，货号60004-1-1g、10176-2-AP、28731-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K） 抗体、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K） 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号A22996、AP0854）。

1.4 仪器 分析天平（北京赛多利斯天平有限公司，型号ALC-210.2）； 全波长酶标仪 （美国Thermo 公司，型号Multiskan FC）； 离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号TGL-16M）； 病理切片机（上海莱卡仪器有限公司，型号GT1001）； 正置荧光显微镜（日本尼康公司）；恒温箱（武汉奥普斯试验设备有限公司，型号LGF-070A）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号JB-P5）； 脱色摇床（北京六一仪器有限公司，型号WD-9405A）。

2 方法

2.1 网络药理学研究

2.1.1 黄芪建中汤与FD 潜在靶基因筛选 通过TCMSP 平台查询黄芪、桂枝、白芍、生姜、甘草、大枣活性成分，以口服生物利用度（OB） ≥30%、类药性（DL） ≥0.18为条件，筛选出药物有效成分及相应靶点［11］，并通过UniProt 数据库对靶点名称进行标准化； HERB 本草组鉴获取饴糖活性成分及其作用靶点； 通过GeneCards 数据库，以“functional dyspepsia” 为检索词，检索FD 的治疗靶点。将药物成分靶点和疾病靶点取交集，得到黄芪建中汤治疗FD 的潜在作用靶点。

2.1.2 蛋白相互作用网络构建 将潜在作用靶点输入STRING 数据库构建蛋白相互作用 （PPI） 网络，运用Cytoscape 3.9.0 软件中的Centiscape 插件进行拓扑分析，以网络中所有点 （Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality） 的中位数平均值为标准，3 个拓扑参数值均大于中位数的靶点为核心靶点［12］。

2.1.3 GO、KEGG 通路富集分析 将潜在作用靶点导入DAVID 数据库进行GO、KEGG 通路富集分析，分别选取生物学过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组成（cellular component，CC） 中P值排名前10 位的条目及P值排名前20 位的KEGG 信号通路，利用微生信网站 （http： //www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化分析。

2.1.4 “药物-成分-靶点-通路-疾病” 网络构建 以黄芪建中汤、有效成分、潜在作用靶点、主要通路和FD 作为“节点”，节点间的相互作用作为“边”，构建“黄芪建中汤-有效成分-潜在作用靶点-主要通路-FD” 网络图，并通过Cytoscape 3.9.0 软件进行可视化。

2.1.5 分子对接 通过PDB 蛋白数据库寻找大分子结构信息，PubChem 得到小分子3D 结构，运用Auto Dock Tools及PyMOL 对裸蛋白进行去水、加氢、检查电荷等前处理，Open Babel GUI 软件转换格式，利用Auto Dock Vina 分子对接，采用PyMOL 进行可视化处理。

2.2 动物实验

2.2.1 模型建立 将48 只小鼠编号后称定体质量，随机分为空白组、模型组、阳性组及高、中、低剂量组，每组8 只。依据文献［13］ 报道采用综合因素（碘乙酰胺＋饥饱失常＋游泳竭力＋L-精氨酸/冷大黄水煎液） 复制脾胃虚弱型FD 模型，持续8 d。

2.2.2 给药及一般生存状态观察 造模结束后，根据人与动物体表面积系数换算［14］，高、中、低剂量组小鼠给药剂量分别为15.38、7.67、3.84 g/kg 黄芪建中汤； 阳性组小鼠灌胃枸橼酸莫沙必利分散片，给药剂量为1.35 mg/kg；空白组与模型组每天灌胃给予等量体积生理盐水，连续14 d。实验过程中观察各组小鼠一般生存状况，并记录体质量、进食量、饮水量、毛发、游泳耐力等指标。

2.2.3 标本采集 给药结束后小鼠禁食24 h，称定体质量并处死，颌下静脉取血，离心，取血清，剪取胃、十二指肠组织，于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理实验； 其余十二指肠组织装入无菌离心管中，液氨中冷冻，放入-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白免疫印迹法（Western blot）检测。

2.2.4 胃排空率及小肠推进率检测 给药结束后，小鼠禁食不禁水24 h，称定体质量后灌胃给予黑色半固体糊状物0.4 mL/只（3 g 羧甲基纤维素钠溶于80 mL 蒸馏水中，依次加入奶粉5 g、蔗糖4 g、淀粉4 g、活性炭末2 g，搅拌均匀，即得），20 min 后处死，迅速开腹，将幽门至回肠部剪下，测量幽门至炭末前沿和幽门至回肠部的距离，计算小肠推进率，公式为小肠推进率＝ ［L（以幽门为起点至黑色糊状物推进距离） /S（小肠全长）］ ×100%。取出全胃，称定质量，沿胃大弯剪开，生理盐水充分冲洗清洁后称量胃净重，计算胃排空率，公式为胃排空率＝ ［1- （胃总重-胃净重） /所给糊重］ ×100%。

2.2.5 胃肠组织HE 染色病理学分析 取于4%多聚甲醛中固定24 h 以上的小鼠胃、十二指肠组织，修切、脱水、石蜡包埋、切片后苏木素-伊红染色，镜下观察组织形态结构。

2.2.6 ELISA 法检测小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平 取各组小鼠血清，按照ELISA 试剂盒说明书检测GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平。

2.2.7 Western blot 法检测十二指肠组织PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表达 提取小鼠十二指肠组织总蛋白，二喹啉甲酸法（BCA） 法测定蛋白浓度，经凝胶电泳、转膜、封闭、洗涤后孵育相应一抗和二抗，暗室显影，分析条带灰度值，计算各目的蛋白相对表达。

2.2.8 免疫组化法检测十二指肠组织EGFR 蛋白表达 小鼠十二指肠组织经包埋、切片后，按试剂盒说明书进行免疫组化EGFR 染色，苏木素染细胞核为蓝色，表皮生长因子受体（EGFR） 表达的阳性结果为棕黄色。

2.2.9 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芪建中汤与FD 潜在作用靶点蛋白相互作用网络 筛选得到黄芪建中汤有效成分123 种，对应2 165 个作用靶点，去重后得到308 个； FD 疾病靶点1 367 个。将药物靶点与疾病靶点取交集后得到潜在作用靶点172 个。将其输入STRING 数据库生成PPI 网络，通过Cytoscape 3.9.0 软件进行拓扑分析，最后得到37 个核心靶点，见图1，排名前15 位的关键核心靶点拓扑信息见表1。

表1 关键作用靶点相关拓扑参数

图1 PPI 网络中37 个核心靶点网络图

3.2 GO、KEGG 通路富集分析 GO 富集分析共416 条，其中BP 共187 条，主要富集在对基因表达的正向调控、药物反应、对乙醇的反应等； CC 共110 条，主要富集在细胞外空间、细胞外区域、大分子复杂等； MF 共119 条，主要富集在酶结合、相同的蛋白质结合、蛋白质同二聚体活性等，选取GO 分析各排名前十的功能条目进行可视化。KEGG 通路富集分析共得到199 条相关通路（P＜0.01），主要富集在弓形体病、TNF 信号通路、癌症通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路、IL-17 信号通路、脂质与动脉粥样硬化等信号通路，选取排名前20 条通路进行可视化。见图2。

图2 黄芪建中汤治疗FD 靶点GO （A）、KEGG （B） 富集分析图

3.3 黄芪建中汤治疗FD 的“药物-成分-靶点-通路-疾病”网络 图3 显示，网络中共涉及459 个节点和3 145 条边，平均度值为13.70，平均相邻节点数目为6.852，网络中心度为0.446，最短路径为3.036，说明黄芪建中汤治疗FD的过程是多成分、多靶点起效的复杂网络，与中药作用的整体性、系统性和综合性相吻合。

图3 黄芪建中汤治疗FD “药物-成分-靶点-通路-疾病” 网络图

3.4 分子对接 选择排名靠前的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和柚皮素，与交互网络中度值较高的关键核心靶点EGFR、Akt1、CASP3 和VEGFA 进行分子对接，结合能越小，分子之间亲和力越好，＜-7 kcal/mol 表示亲和活性良好，＜-9 kcal/mol 表示亲和活性非常强［15］； 对接得分越低，配体与靶点之间结合越稳定，结果见表2。再根据对接评分筛选最佳结合模式，进行可视化分析，结果见图4。

表2 核心成分与关键靶点结合能

图4 分子对接结果可视化分析图

3.5 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠胃排空率及小肠推进率的影响 与空白组比较，模型组小鼠小肠推进率、胃排空率降低（P＜0.05，P＜0.01）； 与模型组比较，各给药组小鼠小肠推进率、胃排空率升高（P＜0.05，P＜0.01），见图5。

图5 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠胃排空率、小肠推进率的影响（±s，n＝8）

3.6 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平的影响 与空白组比较，模型组小鼠血清GAS、IL-6 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），MTL、5-HT 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）； 与模型组比较，阳性组和高、中剂量组小鼠血清GAS、IL-6 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），MTL、5-HT 水平升高（P＜0.05，P＜0.05），而低剂量组小鼠血清GAS、IL-6 水平降低（P＜0.05），MTL 水平升高（P＜0.05），见图6。

图6 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平的影响（±s，n＝8）

3.7 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠胃、十二指肠组织病理形态的影响 各组小鼠胃组织结构清晰，胃黏膜整齐完整，未见明显炎细胞、水肿、充血等病理改变。空白组小鼠十二指肠黏膜整齐完整，未见明显炎性浸润； 模型组小鼠十二指肠绒毛排列散乱，黏膜层出现肿胀、炎性浸润现象； 与模型组比较，各给药组十二指肠绒毛排列整齐程度有所改善，黏膜层炎性细胞浸润出现不同程度改善，见图7。

图7 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠胃、十二指肠组织病理形态的影响（HE 染色，×100）

3.8 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠十二指肠组织PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的影响 与模型组比较，阳性组和高、中剂量组小鼠十二指肠组织p-Akt、p-PI3K 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01），见图8。

图8 黄芪建中汤对各组小鼠十二指肠组织PI3K/Akt 通路蛋白表达的影响（±s，n＝3）

3.9 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠十二指肠组织EGFR 蛋白表达的影响 空白组几乎不见EGFR 的阳性表达； 与模型组比较，各给药组EGFR 表达升高（P＜0.05，P＜0.01），见图9。

图9 黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠十二指肠组织EGFR 蛋白表达的影响（×200，±s，n＝3）

4 讨论

FD 是一种典型的身心共病的慢性疾病，因其病理的复杂性及与精神情绪的密切相关性严重影响患者生活质量、身心健康。西药可在短时间内改善患者的临床症状，但由于副作用不宜长时间服用，且停药后较易复发。中医药治疗FD 可以从改善消化道症状和精神症状两方面同时发挥作用，不良反应小，更适合长期治疗，逐渐成为首选的治疗方法。

黄芪建中汤作为健脾类经典方，建中气、补脾胃、平调阴阳，使气血生化有源，阴阳升降之枢调和，主要集中于治疗消化系统疾病［16］。当机体长期处于精神刺激下可导致神经内分泌免疫调节功能失常，出现恶心、呕吐、纳差、腹胀、腹痛等症状，称为脑肠轴分泌异常［17］，被视为FD发病的重要核心机制之一。GAS、MTL、5-HT 是重要的脑肠肽物质，对胃肠功能具有调节作用，此外，5-HT 也是参与心理、神经功能调节的重要神经递质［18］。IL-6 调控炎症的多种信号通路，作为重要的炎症因子，IL-6 在胃黏膜中水平变化也侧面反映了机体的炎症及受损程度［19］。本研究结果表明，给药组小鼠胃排空率及小肠推进率增加，小鼠血清GAS、IL-6 水平降低，MTL、5-HT 水平升高，各组小鼠胃组织病理切片均未见明显病理现象，与FD 患者临床症状相一致； 但十二指肠组织病理形态出现不同程度炎症浸润现象，与模型组比较，各给药组均出现不同程度改善，说明黄芪建中汤对脾胃虚寒型FD 小鼠脑肠-轴功能紊乱具有改善作用，可促进胃动力，抑制炎症反应，保护小鼠胃肠黏膜。

分子对接结果发现，度值排名靠前的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素与核心靶点Akt1、VEGFA、CASP3、EGFR 分子生物结合亲和力高，具有较好的药效活性。网络药理学PPI 网络分析得到37 个核心靶点，KEGG 主要富集在PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路等。PI3K-Akt 信号通路是细胞内重要的信号转导通路，参与调节细胞的凋亡、增生、迁移、分化和代谢。（EGFR是重要的胃黏膜防御因子，是PI3K/Akt 信号通路几个关键上游调控蛋白之一［20］。EGFR 通过激活Akt、PI3K 等下游靶点来调控细胞增殖、分化、凋亡等多种重要的生物学过程，抑制胃酸和胃蛋白分泌，改善胃黏膜血流，降低IL-6水平，保护胃黏膜免受损伤，在胃黏膜的修复过程中起着重要的作用［21］。本研究结果显示，各给药组十二指肠PI3K-Akt 信号通路被激活、EGFR 蛋白表达上调，提示可针对FD 症状，黄芪建中汤通过上调EGFR 进而激活作用于PI3K/Akt 生存通路，使胃防御因子启动自我修复机制，增强了胃黏膜的修复水平，发挥治疗的作用。

近年来中医药发展较快，许多中医药开始广泛应用于FD 的治疗中，有效提高了该疾病的治疗效果。本研究运用网络药理学预测了黄芪建中汤治疗脾胃虚寒型FD 的关键成分、核心靶点及主要通路，并通过动物模型进行验证，以期为黄芪建中汤临床进一步应用于治疗FD 提供理论依据。