一株源自传统大豆发酵食品中纳豆菌株的分离鉴定与分析

徐林通，张冬鹤，侯进慧，李宁宁，谈晟含，文 宇

（徐州工程学院，江苏徐州 221018）

0 引言

纳豆菌，又名纳豆枯草芽孢杆菌，属枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种，是革兰氏染色阳性菌，芽孢的形状是柱状或者椭圆形[1]。纳豆菌在不同生长时期的生长形态具有差异，在延滞期时，菌体结构如长链形状一般；在对数生长期末期，菌体开始断裂，结构形似短杆[2]。纳豆菌具有提高记忆力、促进代谢、软化血管、调整肠道功能及提高免疫力等方面的功效[3]。据记载，在抗生素还没有被发现之前，普通百姓就是通过以纳豆为食，治疗消化道方面的疾病[4]。这是因为纳豆菌是好氧菌，被人体食入，耗尽肠道内的氧气，氧气全无，一些有害的好氧菌就无法生存，对志贺氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等都能有很好的抑制作用。Hsu M F 等人[5]研究了用纳豆菌发酵黄芪产品在保健美容等领域的应用，研究结果证实，这种乳酸菌产品能够提高人类皮肤中成纤维细胞内胶原蛋白的生物合成，进而减少了细胞外基质蛋白质由于年龄而增加的损失。

纳豆发酵时，可通过枯草杆菌（Bacillus subtilis） 产生纳豆激酶。纤溶活力是纳豆激酶最明显的特征[6]。我国研究人员对纳豆激酶展开了研究，并且在纳豆激酶的基因克隆和表达上取得了一定的进展[7]。从体外试验可得出以下结论，溶解纤维蛋白凝块需要纳豆激酶和纤维蛋白酶一起作用。在动物试验中通过静脉注射操作后，血纤维蛋白溶酶的纤溶能力低于纳豆激酶[8]。在临床试验中，服用纳豆激酶可使健康人群血栓溶解面积提升。纳豆激酶除了可静脉注射，直接服用的药效也很好[9]。纳豆激酶在众多溶栓剂中有溶栓效果好、原料容易获取、价格便宜等优点，备受消费者喜爱，更是各国溶栓剂研究的热点。试验对分离自我国传统大豆发酵食品中的纳豆菌进行了分析。

1 材料与方法

1.1 使用的试剂及设备

研究所选用的生化试剂均是分析纯试剂。主要试剂有蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉、DNA Marker、T 载体、加样缓冲液（6x）、0.25% 溴酚兰、40%蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭（EB），购自国药集团等试剂公司。

液体LB 培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g，用ddH2O 定容至1 L；固体培养基中再加入琼脂粉20 g，高压灭菌后备用。

所使用的仪器设备主要有分析天平、灭菌锅、恒温培养箱、超低温冰箱、电泳仪、凝胶观察仪、常温离心机、摇床、数显恒温水浴锅、移液器等。

1.2 菌株分离与纯培养

通过固体培养基上划线纯培养方法，获得纯的微生物菌种。将接种的培养皿置于28 ℃恒温箱中培养，倒置培养24 h 后，观察菌种分离效果。

1.3 生理生化性质分析[10]

通过分析菌株的生理生化性质，分析菌株的分类地位，所采用的分析方法主要有以下几种。

1.3.1 触酶试验

用无菌接种环挑取菌种纯培养物，小心地放在已灭菌的培养皿上，用移液枪吸取适量新鲜配制3%的H2O2滴在菌株上，立即观察是否产生气泡，若立刻产生大量气泡，则该菌为过氧化氢酶阳性，无气泡则为阴性。

1.3.2 淀粉水解试验

采用鲁哥氏碘液检测，若菌落周围出现透明圈，则该菌为阳性，反之则为阴性。

1.3.3 吲哚试验采用吲哚试剂和乙醚进行检测，试管溶液反应后，出现玫瑰红色为阳性，无玫瑰红色为阴性。

1.3.4 乙酰甲基甲醇试验（V-P 试验）

将菌种在葡萄糖蛋白胨水培养基培养24~48 h。培养结束后，摇匀试管。吸取体积分数为6%α-萘酚酒精溶液1 mL，振荡均匀，吸取加入质量分数为40%的KOH 溶液0.4 mL，用无菌玻璃棒蘸取微量肌酸，伸入培养基混合均匀，放入37 ℃恒温培养箱中培养20 min。若培养液产生红色为阳性，如无红色则为阴性。

1.3.5 甲基红试验（M.R 试验）

将菌株在葡萄糖蛋白胨水培养基培养24~48 h。培养结束后，将甲基红指示剂沿试管内壁滴入。如培养液发生红色反应则为阳性，无红色反应则为阴性。

1.3.6 硫化氢试验

将菌种在醋酸铅培养基培养24~48 h。培养结束后，观察培养基上菌株周围是否变黑，判断该菌株能否生成硫化氢。

1.3.7 柠檬酸盐试验

将菌种在柠檬酸盐培养基培养24 h。培养结束后，将培养基取出观察是否发生颜色变化。

1.3.8 葡萄糖发酵试验

将菌种接种于以葡萄糖作为碳源的发酵液中，振荡使菌种在培养基中均匀分布，培养24~48 h。培养结束后观察紫色发酵液有无变化，如果培养基变黄说明该菌种可产酸。

1.3.9 明胶水解试验

用接种针挑取菌种穿刺接种到明胶培养基，于21 ℃恒温环境中培养7 d 或更长时间，每天观察穿刺培养部分的状态。记录明胶培养基是否仍然凝固，穿刺培养周围有无出现液化。

1.4 基因组DNA 提取与电泳检测

采用苯酚-氯仿有机溶剂抽提的方法[11]，提取菌株基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳方法分析DNA的提取情况。

1.5 菌株16S rDNA 序列分析

通过PCR 扩增的方法获得菌株16S rDNA，引物序列是F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[12]。扩增后，将PCR 产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，分析目的条带扩增情况。将无杂质的目的基因扩增产物送上海生工进行测序。使用生物信息学软件对菌株16S rDNA分子序列进行分析，做出演化树，确定菌株分类地位。

1.6 菌株纳豆激酶基因和酶蛋白分析

利用在线数据库中纳豆激酶基因序列特征，设计扩增引物，所采用的纳豆激酶引物如下：

以菌株基因组DNA 为模板，扩增纳豆激酶基因序列。利用生物信息学软件进行分析。分析获得基因对应的氨基酸序列，在Swiss 网站上进行在线分析，确定其三维结构[13]。

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化与菌落特征分析

从我国传统大豆发酵食品中，分离多株菌株。对其中纳豆激酶活性较高的1 株菌株SD1 进行了研究。利用划线纯培养方法获得菌株单菌落，其菌落颜色呈现灰白色，菌落表面干燥，边缘有褶皱，中心无突起，整体平滑，呈现出芽胞杆菌的菌落特征。

菌株SD1 的菌落特征见图1。

图1 菌株SD1 的菌落特征

2.2 菌株生理生化特征分析

通过试验分析获得菌株的生理生化特征，将其特征与纳豆菌和枯草芽孢杆菌的特征相比较。纳豆菌与枯草芽孢杆菌的分类地位接近，因此其生理生化特性大多一致。所分析的SD1 菌株与纳豆菌的生理生化特性一致，特别是葡萄糖产气方面，呈现阴性。枯草芽孢杆菌的葡萄糖产气结果则是阳性。

生理生化试验结果见表1。

表1 生理生化试验结果

2.3 菌株16S rDNA 扩增与分子分类特征

通过有机溶剂抽提的方法，提取菌株SD1 的基因组DNA 作为模板，扩增其16S rDNA 分子序列。在PCR 扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出1 条符合预期结果的特异性条带。

PCR 方法扩增菌株16S rDNA 分子的电泳结果见图2。

图2 PCR 方法扩增菌株16S rDNA 分子的电泳结果

2.4 菌株SD1 的16S rDNA 序列及分析

将该16S rDNA 送生物公司进行测序，利用重叠序列进行拼接，获得了1 条长度为1 394 bp 的DNA序列。通过NCBI 数据库中的相关序列，制作菌株分子演化树。

菌株SD1 的16S rDNA 序列见图3，菌株SD1 的16S rDNA 演化树分析结果见图4。

图3 菌株SD1 的16S rDNA 序列

图4 菌株SD1 的16S rDNA 演化树分析结果

利用BLAST 程序，在NCBI 网站上比较分析该序列，确定菌株SD1 属于芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 的1 个种。

2.5 菌株SD1 纳豆激酶基因PCR 扩增与分析

以菌株SD1 基因组DNA 为模板，利用纳豆激酶引物进行PCR 扩增，可扩增出1 条特异性的纳豆激酶目的条带。结果显示，扩增出1 条明显的特异性条带，大小在1 200 bp 左右，符合预期。将菌株SD1 纳豆激酶基因PCR 样品送到生物公司进行测序，获得了长度为1 174 bp 的基因序列。将菌株SD1 的纳豆激酶基因序列翻译成氨基酸序列。

菌株SD1 纳豆激酶基因PCR 电泳结果见图5，菌株SD1 的纳豆激酶氨基酸序列见图6。

图5 菌株SD1 纳豆激酶基因PCR 电泳结果

图6 菌株SD1 的纳豆激酶氨基酸序列

2.6 菌株SD1 纳豆激酶三维空间结构模拟与分析

将菌株SD1 的纳豆激酶氨基酸序列在https：//swissmodel.expasy.org/网站上进行在线分析，模拟其三维空间结构，推测氨基酸位点的空间结构。预测三维结构中，含有6 个α- 螺旋，12 个β- 折叠。在6 个α- 螺旋中，每2 个一组形成αα超二级结构，共有3 个αα超二级结构，分别位于三维结构的左、中、右。12 个β-折叠中，有4 个与图中右侧的αα超二级结构接近，有8 个与中间的αα超二级结构接近。

菌株SD1 纳豆激酶模拟三维空间结构见图7。

图7 菌株SD1 纳豆激酶模拟三维空间结构

3 结论

通过平板划线分离法，获得多株产纳豆激酶菌株，对其中纳豆激酶活性较高的菌株SD1 进行了分析。由菌落形态可以看出，菌株SD1 的菌落颜色是白色，菌落表面干燥，边缘有褶皱，中心无突起，整体平滑，呈现出芽孢杆菌的菌落特征。在NCBI 网站利用BLAST 程序对菌株SD1 的16S rDNA 分子序列和数据库中的序列进行比对分析，结果显示菌株SD1 是枯草芽孢杆菌属，结合生理生化性质分析，初步确定菌株SD1 是纳豆菌。利用设计的纳豆基因引物，以菌株SD1 基因为模板，扩增出纳豆激酶基因1 174 bp 条带。以DNA 序列为基础，通过生物信息学软件推导出氨基酸序列，在Swiss 网站上进行在线分析，获得纳豆激酶三维空间结构。预测的三维结构中，含有6 个α-螺旋，12 个β-折叠，在空间上形成3 个αα超二级结构，分别位于三维结构的左、中、右。12 个β-折叠中，有4 个与右侧的αα超二级结构接近，有8 个与中间的αα超二级结构接近。对于纳豆菌株SD1 的研究，为新型纳豆菌和纳豆激酶的开发应用提供了研究基础。