透视·鸡胚骨骼的炫彩世界

金谕青

探寻炫彩世界的神秘钥匙

骨骼是身体的支撑系统，不仅为动物提供结构稳定性和运动功能，还保护着内部脆弱的脏器，如心脏、肺脏和大脑。通过胚胎骨骼透明染色实验，我们可以赋予软骨鲜艳的蓝色，而让硬骨呈现深邃的红色。这种技术可以在不损毀肌肉组织的情况下清晰地呈现软骨和硬骨的胚胎发育过程。那么，动物肌肉到底是如何变得透明的？骨骼又是如何“穿上”光鲜的衣裳公之于众的？

动物肌肉的透明程度与折射率的匹配度息息相关。当肌肉组织的折射率与介质（如甘油）相近时，光线通过组织时的散射和折射程度会降低，更容易透过组织，使组织变得透明。氢氧化钾作为一种碱性溶液，可以降解一些不利于光线穿透的生物成分，如蛋白质、脂质和血红素，从而减少组织内的散射源，提高透明度。此外，氢氧化钾还能与细胞膜中的磷脂发生反应，引发皂化作用。这个过程会破坏细胞膜结构，使细胞内的物质溶解到溶液中，进一步增加透明度。

软骨和硬骨能够呈现不同的颜色，归根结底是与异性相吸有关。阿利新蓝是一种阳离子染料，软骨细胞内富含的糖胺聚糖，如硫酸软骨素和透明质酸等这些带负电的酸性物质成分正好与带正电的阿利新蓝染料结合，将软骨染成蓝色；而属于阴离子染料的茜素红在溶液pH值为12左右时，又可以与硬骨中大量存在的钙离子“碰撞出”深红色化合物，使得硬骨呈红色。

用钥匙开启新世界的大门

为了运用染色技术观察鸡胚的骨骼发育，我们于2023年7月购买了红瑶鸡的种蛋，并进行了孵化。在实验前，我们可以提前配制相关试剂，例如预透明液、脱色剂等。

实验过程大致分为10个步骤：固定、去皮、软骨染色、脱水、复水、预透明、硬骨染色、脱色、再透明、保存。首先将胚胎从蛋壳中剥离，清洗干净后放入75%酒精溶液密封浸泡2～5天，保持组织完整，并脱去部分水分。在固定期间，我们需择日对长有表皮和毛发的胚胎做去皮处理，以免影响染料的渗透。这里将一个去皮小技巧分享给大家：在腹部稍下的位置轻轻地提起表皮，用手术刀划开一处小口，分别向前、向后撕去表皮，双翼部分及爪部应小心处理。

固定期结束后，将标本放入阿利新蓝染剂中浸泡。具体浸泡时间应根据标本的体形大小适当调整，当观察到软骨表层呈蓝色就代表染色成功了。染色完毕后，脱水和复水处理紧随其后。可能有人在此会产生疑惑，为什么刚在无水酒精中脱完水的标本又要降梯度复水呢，岂不是多此一举？其实，复水处理是为了让标本处于一个中性的环境，并脱去标本表面残余的酒精溶液，为后续进入碱性的预透明环节作铺垫。千万注意，不能为了省事就将标本直接从无水酒精转入蒸馏水中，这样会使原本紧致的肌肉遇水突然膨大而暴裂。

接下来的预透明环节极为重要，踏入透明世界的第一步就在这一环节，然而这也是极易“翻车”的步骤。只有利用预透明液将胚胎的肌肉组织透明化，骨骼才能崭露头角。在此环节中，我们需要对鸡胚保持时刻关注，透明时间太长会出现标本“散架”的情况。我们应该至少每隔2小时观察一下胚胎的透明情况，直至肌肉透明呈果胶状。在移动标本的时候需格外小心，因为此时的标本已经变得非常柔软脆弱。

预透明后的硬骨染色也是至关重要的一步，染色时间太短会导致染色不均的后果，而时间太长，又会造成不可逆的过度染色的情况。所以，染色过程也要随时观察，避免时间过长，影响肌肉脱色和整体透明效果。在染色时，肌肉等软组织也会被染上颜色，这时候我们需略施小计，使用脱色剂将软组织上的颜色脱掉，让骨骼大放异彩。但是，在肌肉脱色的过程中，染色的骨骼也可能会被脱去颜色，所以我们仍需随时观察脱色情况，在骨骼未褪色之前结束此步骤。

实验的最后就是使用甘油与低浓度氢氧化钾的混合液进行升梯度再透明，待骨骼完全显现，即可装瓶欣赏和研究。

揭开炫彩世界的神秘面纱

通过观察不同发育时期的胚胎染色标本，硬骨和软骨能够快速地被肉眼识别，其大小、形状、发育规模和趋向统统一览无余。如果有幸捕捉到骨骼发育的起点，我们还可以依据骨骼早期着染的颜色来判断其骨骼的发育方式。

本实验有幸“邀请”到了一位幸运观众——鸡的趾骨。趾骨的发育方式是软骨成骨。什么是软骨成骨？顾名思义，就是在骨骼发育过程中，先形成软骨，然后软骨组织被硬骨取代，完成骨骼的发育。这些骨骼首先会被染成蓝色，随着胚胎发育的进展，可以清晰地看到红色逐渐取代了蓝色，这也就是软骨骨化的过程。

在第六天的胚胎中，鸡胚2～4趾露出雏形，而1趾还“躲”在皮肤里，尚未出现。在第八天的标本中，所有脚趾以通体蓝色的形态出现并开始分节，这就印证了趾骨发育的软骨成骨方式。在第十四天的标本中，我们可以观察到近端的趾节开始率先变红，这让我们意外地发现趾骨的第一骨化中心在趾的近端（接近脚掌的一端），而非远端。在第十八天的标本中，四趾基本骨化完全，只有骨节连接处保留蓝色的软骨。因为小鸡还在逐渐长大，所以软骨会一直在骨骼的两端不断生长。

与软骨成骨相对的还有一种成骨方式——膜内成骨。通过这种方式发育的骨骼通常不经过软骨阶段，直接由结缔组织发育成硬骨。鸡的颅盖骨、面颅骨和叉骨多以膜内成骨方式发育。

在观察第十四天和第二十一天的鸡胚时，我们的目光被牢牢地“吸附”于四片红彤彤的区域，这是鸡颅盖骨中的额骨和顶骨部分。遗憾的是，我们未能捕捉到额骨和顶骨的发育起点，使得两骨的发生方式无法被讨论。幸运的是，我们能够依据额骨、顶骨的长势推断其愈合方向。在出壳期之后的一段时间，四块骨骼会逐渐向中间靠拢，形成一个完整的“红帽子”扣在鸡的头顶。

大多数的骨块在胚胎出壳前基本骨化完全，而额骨却硬是拉长了发育这条“战线”，这或与它的双重发育起源及尺寸较大有关。

鸡颅骨的各块骨骼通常是由神经嵴和中胚层分别主导发育形成的，这两者之间通常会发育一层界面，防止干扰彼此工作，而恰巧有一界面存在于眶上骨和额骨的交界处，这使得额骨下界的发育受到神经嵴细胞和中胚层细胞的双重影响，变得迟缓。这也就能解释为什么发育到孵化期三分之二的额骨仍然表现为一条细缝状红线。

继续探索辽阔的透明世界

值得一提的是，在实验过程中总会遇到复杂多变的状况。其一，预透明的时间非常难掌握，唯一的解决办法就是勤观察、多试错。其二，硬骨和软骨染色不均匀是实验中遇到的一个大问题。硬骨染色不均尚可以通过直接复染进行解决，而软骨染色不均就没有那么轻松了。

令人遗憾的是，因本次实验取样不全，未能记录到胚胎中各个骨骼的确切骨化过程，但“不满是向上的车轮，能够载着不自满的人前进”，这些遗憾是我们在这光彩夺目的透明世界继续探索下去的动力。

作者单位|沈阳师范大学古生物学院