中药药理学贯通性实验的设计及应用 *——以凉膈散为例

余景滔 姜 丽 方小川 卢子滨 余林中 陈育尧 曹惠慧 区锦莹 刘俊珊

（南方医科大学中医药学院广东省中药制剂重点实验室，广东 广州 510515）

中药药理学是以传统中药学与现代药理学为主体的实践性新兴交叉学科。实验是本学科的基础，通过实验教学可强化学生对中药药理学科研思维及技能的掌握，提高教学质量［1］。教育部明确指出，实践育人特别是实践教学依然是高校人才培养中的薄弱环节，与培养拔尖创新人才的要求还有差距。因此切实开展中药药理实验教学改革是非常必要的。贯通性实验教学注重内容的连贯性，强调知识间的相互联系与交叉，可以促进学科知识融合，加深学生对课程理论的理解，提高实验教学质量。然而迄今国内尚未有完善的中药药理学贯通性实验教学方案，因此文章聚焦于贯通性实验，结合现有教学基础条件及中药药理学教学团队的教学改革实践经验，进行中药药理学实验教学的改革。

凉膈散（LGS）为中医温病经典名方，首载于《太平惠民和剂局方》，由连翘、栀子、黄芩、甘草、薄荷、大黄、芒硝7 味药组成，具有泻火解毒、清上泄下的功效，主治中上二焦火热证。除芒硝外，凉膈散中其余药物均有抗氧化作用［2-7］，其中的大黄、芒硝为泻下药，具有泻下通便作用，能改善肠运动［8，9］。本课题组研究结果［10，11］表明，凉膈散具有抗炎作用。此外，现代药理研究［12-14］表明，凉膈散中部分中药如栀子、黄芩、甘草及大黄，均具有镇痛作用。因此本研究以凉膈散为核心，建立抗氧化、组织平滑肌运动调节、泄下、抗炎和镇痛的贯通性实验方案，系统地从细胞分子-器官-动物等不同层次对凉膈散进行药效评价，探究其不同的药理作用，从而进一步加深学生对中药药理学课程的理解。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器HW-400S 型恒温平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司）；PCLAB-UE型生物医学信号采集处理系统（北京微信斯达科技发展有限责任公司）；Thermo 酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；JA3003N型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；N-1200B型旋转蒸发仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；DGX-9243BC-1型冷冻干燥器（中国上海福玛实验设备有限公司）。

1.2 药材与试剂凉膈散所含中药由广州康美药业有限公司提供，经南方医科大学中医药学院张宏伟副教授鉴定；磷酸钠盐口服溶液（今辰清）［上海海虹实业（集团）巢湖今辰药业有限公司］。

1.3 实验动物SPF级昆明种（KM）雌性小鼠，体质量18～22 g，购于南方医科大学实验动物管理中心。

2 方法

2.1 凉膈散的制备依据文献［15］煎煮方法，将凉膈散生药制备成浓度为1 mg/mL的药液。

2.2 凉膈散抗氧化实验将50 μL 不同浓度凉膈散或50 μL 维生素C（Vitmin C，10 mg/mL）与150 μL DPPH溶液（0.2 mmol/L）混合，加入96 孔板中。共分为4 组，凉膈散组、维生素C 组、凉膈散空白组及维生素C 空白组，每组设3 个复孔。室温下反应20 min，波长517 nm测量吸光度值，计算清除率。清除率=［1-（样本OD值-空白OD值）/对照OD值］×100%。

2.3 凉膈散对小肠离体平滑肌的影响平滑肌槽中台式液预温至38 ℃；剪取小鼠1.5～2.0 cm离体空肠，线钩勾住肠管两端，调整前负荷约2 g，基线调零，稳定后记录正常收缩曲线。给药乙酰胆碱（10 μg/mL）、阿托品（50 μg/mL）、凉膈散（100 mg/mL），分别采集数据，计算给药的张力增值，比较结果。张力增值=给药后张力-给药前张力。

2.4 凉膈散对小鼠小肠运动的影响将36 只小鼠随机分为6 组，每组6 只，即空白组、凉膈散最高剂量组（40 g/kg）、凉膈散高剂量组（20 g/kg）、凉膈散中剂量组（10 g/kg）、凉膈散低剂量组（5 g/kg）、今辰清（SPOS）组（2.64 g/kg），准确称量小鼠体质量并记录。以3%印度墨水为指示剂，与凉膈散药物混合，依据小鼠体质量，按0.2 mL/10 g 给药剂量灌胃，给予相应药液。灌胃给药20 min 后，立即颈椎脱臼处死动物，打开腹腔，分离肠系膜，剪下小肠，置于实验桌报纸上。拉直小肠，测量总长度（cm）和墨水推进距离（cm），计算墨水推进百分率，比较各组结果。墨水推进百分率=（墨水推进距离/小肠总长度）×100%。

2.5 凉膈散抗炎镇痛实验

2.5.1 抗硫酸铜诱导斑马鱼炎症实验斑马鱼养殖于南方医科大学人类疾病斑马鱼模型与药物筛选实验室。随机选取受精后3 d 的健康斑马鱼幼鱼60 条，分为6 组，每组10条。给药方式为浸泡给药，分组如下。

空白组：浸泡在egg water中2 h，不予任何处理。硫酸铜模型组：浸泡在含硫酸铜（20 μmol/L）2 mL 的egg water中2 h。阳性对照组：浸泡在含有硫酸铜（20 μmol/L）2 mL 和地塞米松（DEX，10 μg/mL）的egg water 中2 h。凉膈散组：浸泡在含有硫酸铜（20 μmol/L）2 mL 和凉膈散药液高、中、低浓度（300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL）的egg water中2 h。

2 h 后，用0.02%三卡因麻醉斑马鱼并置于琼脂板上固定，在荧光显微镜下观察鱼腹主动脉处中性粒细胞的数量并拍照。

2.5.2 小鼠热板实验取小鼠120 只，随机分为6 组，每组20 只，即空白组、凉膈散最高剂量组（40 g/kg）、凉膈散高剂量组（20 g/kg）、凉膈散中剂量组（10 g/kg）、凉膈散低剂量组（5 g/kg）、扶他林组（0.5 g/kg）；准确称量小鼠体质量并记录。将热板镇痛仪调节至55 ℃，加热后作为热刺激；记录小鼠自投入热板至舔后足的时间，作为该鼠痛阈值。给药前，测定每只小鼠痛阈，5 s≤痛阈值≤30 s为合格；灌胃给药（0.2 mL/10 g）30 min后，再次测定痛阈值并记录。若给药后小鼠60 s 内无舔后足反应，按60 s 记。计算每只小鼠计算痛阈提高百分率，比较各组的结果。痛阈提高百分率（%）=（给药后痛阈值-给药前痛阈值）/给药前痛阈值×100%。

2.5.3 小鼠醋酸扭体实验取小鼠120 只，随机分为6组，每组20 只，分组给药与小鼠热板实验相同。给药30 min 后，每只小鼠腹腔注射醋酸（0.1 mL/10 g），观察并记录每只小鼠20 min内出现扭体反应的次数。

2.6 数据处理及统计采用Graphpad Prism 8.0统计软件处理数据，计量资料以（±s）表示，组间比较行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 设计实验结果

3.1 凉膈散具有抗氧化作用凉膈散对DPPH·自由基的清除率随剂量的增加逐渐提高，当其浓度在700 μg/mL以上时，对DPPH·自由基的清除率为76%，到达平台期。这表明凉膈散可有效清除DPPH·自由基，发挥抗氧化作用，以药物浓度700 μg/mL 及以上效果明显，因此将该浓度用于本科中药药理实验课教学中。见图1。

图1 凉膈散抗氧化实验结果

3.2 凉膈散对小鼠离体肠平滑肌运动具有舒张作用鉴于未见凉膈散全方对小鼠肠平滑肌的作用研究，并且基于凉膈散组方中含大黄、芒硝及甘草等组分可发挥泻下作用，为探索其对小鼠离体肠平滑肌运动是否有舒张或收缩作用，作者通过记录凉膈散、乙酰胆碱及阿托品对小鼠小肠平滑肌运动的影响曲线，并计算平均张力增值、最大张力增值以及最小张力增值。结果显示，乙酰胆碱对小鼠离体肠平滑肌具有收缩作用，凉膈散与阿托品均对小鼠离体肠平滑肌具有舒张作用，且凉膈散松弛作用较阿托品大。见表1。

表1 凉膈散对小鼠离体肠平滑肌运动的影响实验结果 （± s）

表1 凉膈散对小鼠离体肠平滑肌运动的影响实验结果 （± s）

注：与乙酰胆碱组比较，1）P＜0.001，2）P＜0.01，3）P＜0.005。

组别凉膈散乙酰胆碱阿托品最小张力增值-0.178±0.1183)0.074±0.015-0.219±0.033鼠数8 8 8药液浓度100 mg/mL 10 μg/mL 50 μg/mL给药量800 μL 100 μL 100 μL平均张力增值-0.208±0.0641）0.451±0.022-0.210±0.0221）最大张力增值-0.121±0.1562）0.648±0.030-0.190±0.1612）

3.3 凉膈散具有泻下作用基于凉膈散组方中大黄、芒硝等具有泻下作用的药材，进一步通过小鼠肠道推进实验探究其是否能够促进小鼠肠道运动。结果显示，与空白组相比，凉膈散与阳性药SPOS 均可提高墨水在小鼠肠道中推进的距离，给予凉膈散中剂量10 g/kg、高剂量20 g/kg及最高剂量40 g/kg后，墨水推进百分率分别提高至91.8%、92.0%及88.0%，且效果均优于阳性药，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。其中，凉膈散中剂量（10 g/kg）效果较好。见图2。

图2 凉膈散对小鼠小肠运动的影响实验结果

3.4 凉膈散可减轻炎症反应为建立以凉膈散为核心的贯通式实验教学体系，通过构建斑马鱼硫酸铜炎症模型，对其抗炎作用进行评价。结果显示，与空白组相比，硫酸铜模型组斑马鱼神经柱区域（白色线框内）聚集大量中性粒细胞，表明斑马鱼出现急性炎症；凉膈散及阳性药DEX 均可显著减少中性粒细胞向中央弥散，且凉膈散的抑制作用随浓度增大而显著提高。由此说明，凉膈散可抑制硫酸铜诱导斑马鱼中性粒细胞迁移，减轻炎症反应，以浓度300 μg/mL效果最明显。见图3。

图3 凉膈散抗硫酸铜诱导斑马鱼炎症实验结果

3.5 凉膈散具有镇痛作用现代药理研究［14］表明，凉膈散复方中大黄、黄芩、甘草和栀子具有镇痛作用。因此，作者运用热板法和醋酸扭体法探索凉膈散全方对小鼠痛阈值是否有提高。结果显示，与空白组相比，凉膈散中剂量（10 g/kg）组可减少小鼠的舔足和扭体反应次数，与阳性药扶他林效果相当，其在醋酸扭体动物模型上表现出的镇痛作用更为明显。见图4。

图4 凉膈散镇痛实验结果

4 贯通性实验改革的应用

上述研究结果表明，凉膈散能实现分子-器官-动物不同层次的药理作用，满足贯通性实验的要求，故选取凉膈散设计贯通性实验具有合理性和可行性。基于此，作者选取2019 级中药学和中药制药2 个专业学生进行贯通性实验教学实践。收集本科教学实验课结果进行统计分析，结果与上述设计实验一致，表明该实验设计具有较好的可重复性。此外，基于贯通性实验教学实践结果，作者对该教学模式应用于中药学和中药制药2 个专业的实践情况进行调查分析，共收集中药学和中药制药2 个专业学生填写的有效问卷72 份。学生认为该贯通性实验具有下述优点，即实验课参与度高，实验原理及操作掌握程度好；课堂满意度高，能力提升显著。学生对实验课综合评价高，同行评教效果优异，课程讲授评分成绩名列前茅。

5 讨论

中药药理学是中医药高等教育中药学类专业的核心课程，也是中医学及中西医学类专业的基础课程，对于培养学生“理论与实践”相结合的能力有重要意义［16］。实践教学在中药药理学的教学过程中发挥了举足轻重的作用，其方法改革是推动实践教学改革和人才培养模式改革的关键。本研究采用经典名方凉膈散探索实践教学方法改革，并充分利用其具有多重功效的优势，设计了抗氧化、离体平滑肌运动、小鼠肠推进、抗炎、醋酸扭体法和热板法等实验。上述实验从分子、器官、动物不同层次进行中药药理研究，形成比较完善的贯通式实验教学体系，不仅覆盖中药药理学实验课程中的大部分实验内容，还引入了本团队建立的斑马鱼炎症模型，实现了科研和教学的有机融合，取得较好的教学效果。本项目为中医药院校及综合性院校的中药学专业学生进行实验教学提供改革模板及改革思路，具有较高的实践应用价值。