连翘苷通过非calpain 途径升高ABCA1 表达抑制动脉粥样硬化斑块形成

何志迪 金笑平 朱星蓉 王 恩 王 凤 吴 刚 徐逸雯

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性脑卒中、心肌梗死、缺血性心肌病等心血管疾病发生、发展、复发的最常见病因和病理基础[1]。大多数缺血性事件发生的病因是由于AS 易损斑块破裂和内皮糜烂，动脉表面的完整性被破坏而引发血栓形成[2-3]。脂质沉积是AS 的重要病理基础，胆固醇逆转运可将组织中过量的胆固醇转运到肝脏，经过粪便清除，减少脂质在血管壁的沉积，高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）浓度和其含有的游离胆固醇的酯化是胆固醇逆转运和预防动脉粥样硬化性心血管疾病的核心[4]。在胆固醇逆转运系统中，过量的胆固醇通过ATP 结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）绑定到载脂蛋白A1 上从而启动胆固醇逆转运[5]。连翘苷是连翘的重要有效活性成分之一，具有抗炎抑菌、抗氧化、抗感染等药理作用[6]。研究显示，连翘苷可以减轻高葡萄糖诱导的脂质积累[7]，也可以通过自噬缓解小鼠酒精性脂肪肝的发生[8]。本研究旨在探讨连翘苷是否通过调节ABCA1 发挥作用，并研究其影响ABCA1 的具体机制。

1 实验材料

1.1 细胞株与试剂 THP-1 细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC）。连翘苷标准品购自GLPBIO 公司（批号GC38421，提取于连翘，纯度＞98.5%）；维多利亚蓝弹力纤维染色液试剂盒、Masson 三色染液试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司（批号G1596、G1340）；ABCA1 抗 体、ATP 结 合 盒 转 运 蛋 白G1（ABCG1）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司（批号ab66217、ab52617、ab9484）；过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）抗体、肝脏X 受体α（LXRα）抗体、钙激活中性蛋白酶（calpain）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司（批号16643-1-AP、14351-1-AP、11472-1-AP）；钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）抗体购自北京博奥森生物技术有限公司（批号bs-6701R）；Mayer苏木素染色液、伊红染液购自大连美仑生物技术有限公司（批号MB9897-3、MA0164）；HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）测试盒均购自南京建成生物工程研究所（批号A112-1-1、A113-1-1、A110-1-1、A111-1-1）；氧化低密度脂蛋白购自杭州纳秋生物科技有限公司（批号S24879-2m）；小鼠超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、纤维蛋白原酶联免疫吸附试验试剂盒均购自江莱生物（批号JL10346、JL20600）；葡萄糖氧化酶法测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司（批号E1010）。

1.2 动 物 健康雄性APOE-/-小鼠25 只，体质量约30 g，4～6 周龄，北京华阜康生物科技股份有限公司提供[许可证：SCXK（京）2019-0008]。饲养环境：室温20～22 ℃，湿度45%～60%。本研究得到温州医科大学附属台州医院医学伦理委员会批准（审批号：tzy-2020199）。

1.3 主要仪器 低温离心机（型号：5424R，美国赛默飞公司）；酶标仪（型号：Multiskan FC，上海美谷分子仪器有限公司）；细胞培养箱（型号：FORMA3111，美国赛默飞公司）；微型振荡器（型号：HK 96-3，江苏金坭棠华仪器公司）；纯水供应系统（型号：Direct8，法国Millipore 公司）；冰冻切片机（型号：CM1950，德国Leica 公司）；石蜡包埋机（型号：TEC5，湖北孝感阔海医疗科技有限公司）；摊片机（型号：KEDEE，德国Leica 公司）。

2 实验方法

2.1 动脉硬化斑块模型建立 25 只APOE 基因敲除小鼠使用随机数字表法分为五组：（1）空白对照组：普通饲料+0.9%氯化钠灌胃；（2）模型对照组：高脂饲料+0.9%氯化钠灌胃；（3）连翘苷低剂量组：高脂饲料+连翘苷25 mg/（kg·d）灌胃；（4）连翘苷高剂量组：高脂饲料+连翘苷45 mg/（kg·d）灌胃；（5）阿托伐他汀组：高脂饲料+阿托伐他汀10 mg/（kg·d）灌胃。药物干预12 周，每周检测各组小鼠进食情况和体质量。高脂饲料配方为16%猪油、10.5%蔗糖、1.5%胆固醇、72%普通饲料。连翘苷标准品（固体粉质）使用DMSO 溶液配置成所需要的浓度。12 周后对小鼠进行腹腔麻醉，心脏采血，以4000 r/min、离心半径约6 cm 离心10 min，留取血清。小鼠仰卧位固定，剪开胸骨暴露心脏，剪开右心耳放血并缓慢推注0.9%氯化钠，直到右心耳流出的液体基本不带血色，切取主动脉弓至髂动脉分支处的全部主动脉进行病理染色、免疫组化检测。

2.2 血脂血糖等指标检测 血清样本静置，由-20 ℃冰箱放置4 ℃冰箱中，按照试剂盒操作要求检测各项生化指标，包括血糖、HDL-C、LDL-C、TG、TC、hs-CRP、纤维蛋白原水平。

2.3 易损斑块病理学、形态学检查 分离取出主动脉，用预冷的PBS 洗去残血，留取约2 mm 长度主动脉迅速投入液氮中，用于制作冰冻切片，油红O 染色。留取约2 mm 主动脉，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，进行HE 染色、Masson 染色和维多利亚蓝染色。在光镜下观察血管壁AS 病变的组织学形态。

2.4 免疫组化检测ABCA1、LXR-α、PPAR-γ、calpain、calpastatin 的蛋白表达 小鼠主动脉组织进行石蜡包埋后连续切片，后续进行常规脱蜡水化、抗原修复、内源性过氧化物酶灭活、封闭、抗体孵育、DAB显色、苏木素复染、封片等操作。PBS 代替一抗作阴性对照。有棕褐色、棕黄色着色的细胞视为阳性细胞，显微镜观察并用Image J 分析。

2.5 细胞实验 THP-1 细胞置于含100 μmol/L 佛波酯（PMA）的1640 培养液中培养72 h 后，可转变为巨噬细胞。THP-1 源性巨噬细胞以50 μg/mL 的ox-LDL 刺激48 h 后成为泡沫细胞。分为无药物干预的THP-1 细胞组、泡沫细胞组及连翘苷低浓度（25μmol/L）干预组、连翘苷高浓度（100 μmol/L）干预组，干预时间为24 h，提取各组细胞。采用油红O 染色方法对泡沫细胞进行鉴定（泡沫细胞内出现大量被油红O 染成红色的颗粒状脂滴）。Western blot：收集各组经过特定处理的细胞，提取细胞总蛋白，测定并调整各组蛋白浓度，进行8%～12%聚丙烯酰电泳，随后将蛋白转移到PVDF 膜。室温下，用封闭液封闭2～3 h。随后与相关蛋白一抗4 ℃过夜孵育。用TBST 清洗3 次后，与二抗室温下孵育1 h。再次用TBST 清洗3 次后，用ECL plus 荧光检测试剂盒显影。

2.6 统计学方法 应用SPSS 26.0 软件进行数据分析，所有计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 连翘苷对各组小鼠体质量的影响 各组间小鼠初始体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。第12周时，模型对照组、连翘苷低剂量组小鼠体质量大于空白对照组（P＜0.05）；连翘苷高剂量组、阿托伐他汀组体质量小于模型对照组（P＜0.05），而与空白对照组小鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。12周内各组小鼠间的体质量增幅差异与终末体质量差异相似。见表1。

表1 连翘苷对小鼠体质量的影响（g，±s）

表1 连翘苷对小鼠体质量的影响（g，±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05

组别空白对照组模型对照组连翘苷低剂量组连翘苷高剂量组阿托伐他汀组鼠数55555初始体质量20.60±0.55 20.60±0.89 20.40±0.55 21.20±1.10 20.80±0.45终末体质量38.60±0.89 41.40±1.14a 41.20±0.84a 39.20±1.30b 39.40±0.55b体质量增幅18.00±1.00 20.80±1.79a 20.80±1.10a 18.00±0.71b 18.60±0.55b

2.2 连翘苷对各组小鼠血液生化指标的影响 与空白对照组比较，模型对照组小鼠LDL-C、TC、TG 水平显著升高，HDL-C 水平显著降低（P＜0.05）。与模型对照组比较，各给药组小鼠LDL-C、TC、TG 水平显著降低，HDL-C 水平显著升高（P＜0.05）。与空白对照组比较，连翘苷高剂量组小鼠LDL-C、TC 无显著差异（P＞0.05），阿托伐他汀组TC 无显著差异（P＞0.05）。与空白对照组比较，模型对照组、连翘苷低剂量组血糖水平显著升高（P＜0.05），连翘苷高剂量组和阿托伐他汀组无差异（P＞0.05）；各组纤维蛋白原水平较空白对照组均显著升高（P＜0.05）；除连翘苷高剂量组外，其余三组hs-CRP 水平较空白对照组显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 连翘苷对小鼠血液生化指标的影响（±s）

表2 连翘苷对小鼠血液生化指标的影响（±s）

注：HDL-C 为高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C 为低密度脂蛋白胆固醇；TC 为总胆固醇；TG 为三酰甘油；hs-CRP 为超敏C-反应蛋白；与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与阿托伐他汀组比较，cP＜0.05

组别空白对照组模型对照组连翘苷低剂量组连翘苷高剂量组阿托伐他汀组例数55555 HDL-C（mmol/L）5.99±0.46 1.33±0.14a 2.23±0.19abc 3.15±0.27abc 4.27±0.54ab LDL-C（mmol/L）5.34±0.88 16.09±2.08a 10.15±1.30ab 7.10±1.10b 8.25±1.38ab TC（mmol/L）41.85±1.64 65.57±7.47a 47.31±3.38b 44.10±3.38b 44.55±3.29b TG（mmol/L）4.25±0.26 15.03±1.20a 8.50±0.73abc 6.03±0.66ab 6.06±0.49ab血糖（mmol/L）4.21±0.15 5.74±0.22a 5.09±0.23a 4.38±0.08b 4.41±0.14b纤维蛋白原（μg/mL）9.58±1.57 56.11±2.28a 29.11±1.19ab 19.67±2.27ab 14.24±1.08ab hs-CRP（ng/mL）3.32±0.93 17.51±4.39a 12.79±1.35ab 6.65±0.87b 11.28±1.71ab

2.3 连翘苷对各组小鼠主动脉组织病理形态的影响在模型对照组小鼠中可见动脉壁内膜增厚，粥样硬化斑块和胆固醇结晶、钙化。连翘苷低剂量组小鼠动脉壁层次尚清晰。空白对照组、连翘苷高剂量组和阿托伐他汀组小鼠主动脉管壁层次清晰，内膜结构完整，未见粥样硬化斑块、胆固醇结晶或钙化。在油红O 染色中，模型对照组小鼠动脉粥样硬化斑块面积增加，连翘苷各组和阿托伐他汀组均抑制了过量胆固醇沉积，防止了斑块进展。在Masson 染色和维多利亚蓝染色中可见空白对照组小鼠动脉管壁厚度均匀，血管平滑肌细胞整齐，周围胶原纤维结构正常，细胞核大小正常；模型对照组血管平滑肌细胞排列紊乱，胶原分解增多，管壁变薄，斑块易损性增加；与模型对照组比较，连翘苷各组和阿托伐他汀组血管平滑肌细胞胶原纤维分解减少，斑块稳定性增加。见图1。

图1 APOE-/-小鼠主动脉血管染色结果（×40）

2.4 连翘苷对各组小鼠主动脉组织ABCA1、LXRα、PPAR-γ、calpain 和calpastatin 蛋白表达的影响免疫组化结果显示，连翘苷高剂量组ABCA1、LXR-α、PPAR-γ 蛋白表达水平高于空白对照组和模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。连翘苷低剂量组ABCA1 和LXR-α 表达水平高于空白对照组（P＜0.05）。各组之间calpain、calpastatin 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。见图2 和表3。

图2 不同浓度连翘苷对小鼠主动脉组织ABCA1、LXR-α、PPAR-γ、calpain 和calpastatin 蛋白表达水平的影响（免疫组化，×40）

表3 各组小鼠主动脉组织免疫组化ABCA1、LXR-α、PPAR-γ、calpastatin、calpain 平均光密度值比较（±s）

注：ABCA1 为ATP 结合盒转运蛋白A1；LXRα 为肝脏X 受体α；PPAR-γ 为过氧化物酶体增殖物激活受体γ；calpastatin 为钙蛋白酶抑制蛋白；calpain 为钙激活中性蛋白酶；与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与阿托伐他汀组比较，cP＜0.05

组别空白对照组模型对照组连翘苷低剂量组连翘苷高剂量组阿托伐他汀组鼠数55555 ABCA1 0.142±0.009 0.143±0.011 0.160±0.003a 0.163±0.004abc 0.146±0.014 LXR-α 0.163±0.007 0.170±0.008 0.181±0.012a 0.215±0.031ab 0.180±0.007 PPAR-γ 0.168±0.017 0.150±0.007 0.168±0.016 0.201±0.022abc 0.161±0.004 calpastatin 0.236±0.037 0.263±0.054 0.258±0.036 0.251±0.033 0.244±0.022 calpain 0.196±0.021 0.179±0.013 0.183±0.024 0.178±0.036 0.180±0.017

2.5 不同浓度连翘苷对THP-1 源性泡沫细胞及其ABCA1 表达的影响 细胞实验结果显示，泡沫细胞组脂质沉积比连翘苷组更严重，连翘苷有抑制泡沫细胞内脂质沉积的作用，并随着剂量的增加而增强。连翘苷干预后，能明显提高泡沫细胞内ABCA1、ABCG1 蛋白的表达。见图3。

图3 不同浓度连翘苷对泡沫细胞内脂质沉积（A）及胆固醇转运相关蛋白表达水平（B）的影响

3 讨 论

AS 是一种大、中型动脉的慢性炎症性疾病，即动脉壁纤维脂肪病变的形成，可引起缺血性心脏病、脑梗死和周围血管疾病等多种高发病率和致死率性疾病[9]。连翘苷是连翘中主要的多酚类化合物，近年来，连翘苷被证实具有较强的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和抗细菌感染等药理作用，在治疗相关疾病方面具有巨大的潜力[10]。本研究发现，与模型对照组相比，连翘苷可降低APOE-/-小鼠体质量、降低LDLC、TC、TG 水平，其效果与阿托伐他汀相比无明显差异，但是连翘苷升高HDL-C 的作用不如阿托伐他汀。此外，高剂量连翘苷还具有较好的降低血糖、纤维蛋白原及hs-CRP 水平的作用。通过主动脉病理组织染色，观察到高剂量连翘苷可以抑制主动脉斑块的形成，减少血管平滑肌细胞周围胶原分解，改善动脉管壁结构，达到稳定易损斑块的作用。免疫组化结果显示，连翘苷可能是通过上调PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 表达水平而非calpain 途径来抑制胆固醇外流，起到抗AS 的作用。

传统观点认为，在AS 的早期阶段，炎症趋化因子刺激单核细胞使其分化成巨噬细胞，巨噬细胞通过其表面的清道夫受体吞噬氧化低密度脂蛋白，导致胆固醇内流和沉积，形成泡沫细胞，这是构成动脉粥样硬化斑块的基础。细胞中多余的胆固醇被ATP结合盒式（ABC）转运体ABCA1 和ABCG1 排出，并形成HDL[11]。ABCA1 是一种膜转运体，在巨噬细胞中含量丰富，并介导胆固醇外流，平衡脂质吸收和流出的速率。ABCA1 转运蛋白的表达可以在转录水平、转录后水平和翻译后水平进行调控。在转录水平，ABCA1 的表达主要由肝X 受体（LXR）、类视黄醇X受体（RXR） 和过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）等核受体控制[12]。PPAR-α 和γ 通过激活LXR-α 基因的转录间接刺激ABCA1 基因的转录。Fang 等[13]研究表明，连翘苷可以降低肥胖小鼠的甘油循环水平，减少肝脂肪变性，改善胰岛素敏感性，减轻肥胖小鼠脂肪组织中与肥胖相关的炎症和白细胞介素6 的产生，这和本研究结果有相似之处。此外，连翘苷有可能通过降低钠氢交换蛋白1（NHE-1）的基因和蛋白表达减少机体氧化应激，进一步降低AS 相关炎性因子，起到抗AS 的作用[14]。也有研究显示，连翘苷可以上调乙酰化低密度脂蛋白刺激下的骨髓来源巨噬细胞PPAR-γ、ABCA1、ABCG1 及清道夫受体B1 基因表达从而促进巨噬细胞胆固醇外流[15]。本研究中，连翘苷升高PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 的表达，有可能通过该信号通路发挥调节作用。

钙蛋白酶属于钙依赖性半胱氨酸蛋白酶家族，与AS 和炎症有关。在单核细胞/巨噬细胞中，calpain诱导ABCA1 和ABCG1 的蛋白水解降解，导致胆固醇流出受损和随后的巨噬细胞泡沫细胞形成[16]。calpain 抑制剂显著下调清道夫受体CD36 和SR-A 的mRNA 表达，并上调主动脉和腹膜巨噬细胞中参与胆固醇外排途径的基因（PPAR-γ、LXR-α 和ABCA1）的表达[17]。本研究发现，连翘苷导致ABCA1 表达升高，但对calpain 和calpastatin 的表达无影响，表明连翘苷可能不是通过calpain 通路参与ABCA1 的调控。

然而，本研究也有一定的局限性。首先，在动物实验部分未进一步研究连翘苷对calpain/calpastatin的影响；其次，关于连翘苷对THP-1 源性泡沫细胞的研究还不够深入，未证实LXR-α、PPAR-γ 蛋白表达量在连翘苷干预后泡沫细胞中是否升高。

综上所述，连翘苷可以通过非calpain 途径上调ABCA1 水平来抑制胆固醇外流，减轻小鼠体质量，降低LDL 表达，以此起到抗AS 的作用。