草莓炭疽病病原鉴定及拮抗菌株筛选

杨洪俊 张旭 陈佳佳 孙朋朋 张石林 王钧铭 王媛花 颜志明

摘要：草莓炭疽病是近几年草莓生产中的主要病害之一，危害性大、毁灭性强。为明确江苏省镇江市丹徒区草莓炭疽病病原菌种类，并筛选对其有效的拮抗菌株，从丹徒区草莓露天苗圃采集炭疽病发病植株，采用组织分离法对病原真菌进行分离，通过致病性测定，结合形态学和分子生物学准确鉴定其种类，并以此为靶标病原菌，通过平板对峙法筛选拮抗菌株。 结果表明，从草莓植株发病部位共分离获得11株暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense），其中，从根部分离得到2株（D13、D19）、茎部4株（D1、D2、D11、D12）、叶部5株（D8、D9、D10、D20、D21）。经柯赫氏法则验证，C. siamense 为草莓炭疽病病原真菌，其中D8和D19这2株C. siamense致病性较强。从健康草莓植株内分离获得29株内生真菌，以D8和D19作为指示菌，通过平板对峙试验筛选出5株拮抗效果较好的生防菌株，分别为Z72、Z79、Z52、Z107和Z101，其抑菌率均达到了60%以上，其中Z72对D8和D19的抑菌率分别达到了74.07%、79.82%。经鉴定，这5株拮抗菌均为木霉属真菌（Trichoderma spp.）。暹罗炭疽菌为丹徒区草莓炭疽病主要病原菌，具有较强的致病性，草莓内生真菌可为草莓炭疽病微生物防治提供重要资源。

关键词：草莓炭疽病；病原真菌；分离鉴定；致病性；拮抗菌

中图分类号：S436.68+4  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）03-0147-06

我国是世界上最大的草莓生产国，草莓种植面积占比全球近1/3。草莓生产具有周期短、见效快、效益高、果品无公害等特点。随着我国经济的发展以及人们生活水平的提高，市场上对草莓的需求量變大，也吸引越来越多的人种植草莓。而草莓炭疽病是草莓生产过程中的主要病害之一［1-2］。1931年Brooks首次报道草莓炭疽病，该病主要危害草莓的匍匐茎、叶柄、根冠、花及果实等［3］。尤其是密闭的草莓棚及高温高湿环境等利于草莓炭疽病的发生，导致草莓减产25%～30%，在草莓育苗期和定植初期，发病率有时高达80%，严重时造成草莓苗大面积凋萎枯死，严重影响草莓的产量和品质［4］。

目前，除种植一些高抗品种外，草莓炭疽病仍以化学药剂防治为主，但随着病原菌抗药性的不断增强，杀菌剂防治炭疽菌的效果都不太理想且易污染环境，不利于我国绿色农业的可持续性发展［5］。目前生物防治技术是国际上竞相开发的新技术，因其绿色、安全等特点，越来越为人们所关注［6-7］，其作用机制包括诱导抗性、拮抗、竞争、重寄生、促生等。现阶段虽有一些菌株被用于防治草莓炭疽病，但高效的生防资源依然不足，更多有拮抗效果的菌剂产品及其应用技术亟待开发。

本研究通过采集镇江市丹徒区草莓产区草莓炭疽病病株，并对病原真菌进行分离培养，结合形态学和分子生物学准确鉴定其种类，初步明确了镇江市丹徒区草莓炭疽病病原真菌类型。同时，为了筛选拮抗草莓炭疽病的生防菌株，选择29株内生真菌菌株进行平板对峙试验，以期为草莓炭疽病的生物防治提供优质的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发病草莓植株于2022年6月采自江苏省镇江市丹徒区草莓露天苗圃，草莓品种为红颜。拮抗菌株是笔者所在实验室前期分离自健康草莓植株内的内生真菌，包括ZJ5、ZJ6、ZJ7、ZJ8、ZJ11、ZJ14、ZJ17、ZJ28、ZJ33、ZJ36、ZJ41、ZJ42、ZJ45、ZJ47、ZJ49、ZJ51、ZJ52、ZJ63、ZJ66、ZJ72、ZJ75、ZJ77、ZJ79、ZJ81、ZJ93、ZJ95、ZJ99、ZJ101和ZJ107，共29株。

1.2 试验方法

1.2.1 草莓炭疽病病原真菌分离、纯化 采用组织分离法分离草莓病株上的病原真菌［8-10］。在无菌操作条件下，用剪刀剪取发病植株病健交界处的组织（约5 mm×5 mm），先放入75%乙醇中浸泡30 s，再用2%次氯酸钠浸泡2 min，最后使用无菌水连续漂洗3次，用灭菌滤纸片吸干表面水分后，用无菌操作法将病组织小块移至PDA培养基上培养，每皿放置5块组织块，用封口膜封口，于25 ℃恒温箱中培养3～5 d。待发病组织长出菌丝后，用无菌操作法挑取菌落边缘菌丝连同培养基转移至新的PDA平板上，进一步纯化培养。观察菌落的生长情况，挑取菌落边缘的菌丝制成玻片，在显微镜下观察是否为单一菌落，如果观察到的是单一菌落则获得纯培养，若菌落不单一，则需要重复此步骤，直至获得纯培养。

1.2.2 病原真菌鉴定

形态学鉴定：用PDA培养基于25 ℃恒温培养箱中培养草莓炭疽病病原真菌5～7 d，逐日观察菌落形状、大小和颜色等。并挑取边缘菌丝制成临时玻片，用显微镜观察其菌丝、分生孢子等形态特征，初步确定病原真菌种类。

分子鉴定：待病原真菌长满培养皿后，刮取表面菌丝加入液氮充分研磨，按照DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN DNAsecure Plant Kit）操作说明来提取病原真菌基因组DNA，并将DNA产物放于-20 ℃保存，以防DNA降解。

采取通用引物ITS1和ITS4对真菌ITS区域进行PCR扩增。30 μL扩增体系包括：15 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix （+dye），1 μL正向引物（5 μmol/L），1 μL反向引物（5 μmol/L），1 μL模板DNA溶液和12 μL无菌水。PCR扩增反应条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃继续延伸 10 min。对于镰孢菌属物种，笔者扩增了翻译延伸因子EF-1α区域进行确认，对于炭疽菌属物种，笔者分别扩增了钙调蛋白基因（calmodulin，CAL）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、几丁质合成酶A基因（chitin synthase 1，CHS-1）、肌动蛋白基因（actin，ACT）和β-微管蛋白基因（beta-tubulin，TUB）进行确认［11-14］（表1）。对PCR产物进行扩增测序，并与NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST比对，以确定病原真菌种类。

1.2.3 致病性测定

采用创伤接种法进行致病性测定，先用草莓组培苗接种所有分离到的真菌菌株，后根据发病情况在草莓叶片接种病原真菌。首先，准备2个灭菌托盘，各铺上2层无菌纱布并用无菌水湿润。选择长势一致、健康的草莓组培苗，用75%乙醇进行表面消毒，用灭菌接种针轻刺组培苗，切取在25 ℃下培养3 d的炭疽菌菌丝块（约 3 mm2），用无菌接种针将菌丝块贴在创口处，用无菌湿润吸水纸包裹，外面再用无菌锡箔纸包紧，放置在一个托盘中，另一个托盘中的草莓在创口处贴一块空白PDA培养基（约3 mm2）为对照，设3个重复。用保鲜膜密封，放在25 ℃下进行培养，观察发病情况。

叶片接种法为选取新鲜完整的健康草莓叶片，清洗，用75%乙醇表面消毒后放置在灭过菌的托盘中，底层铺上无菌水润湿的无菌纱布来保湿。用灭菌的接种针在草莓叶片两边各轻扎几下以造成创伤，便于病原菌侵入。切取在25 ℃培养3 d的炭疽菌菌丝块（约3 mm2），用无菌接种针放置在叶片两边的伤口上，以接种空白PDA培养基（约3 mm2）为对照，最后用无菌水浸湿过的脱脂棉保湿，并设置3组重复，托盘用保鲜膜密封，置于25 ℃恒温箱中培养，观察发病情况。

1.2.4 拮抗菌株的筛选

1.2.4.1 拮抗菌的初筛

采用PDA平板对峙法进行初筛：用直径5 mm的打孔器在培养5 d后的炭疽病原真菌菌落边缘打孔，并将菌饼接入直径为9 cm的PDA培养基一端，菌丝面与培养基接触。同样操作将拮抗菌用打孔器打孔后，菌饼（直径5 mm）接入培养基另一端，2个菌饼间相距4 cm。以将草莓炭疽病原真菌菌饼单独接入空白PDA平板作为对照，放入25 ℃恒温箱中培养。5 d后测量病原真菌菌落半径，筛选出有抑制效果的拮抗菌株进行复筛。

1.2.4.2 拮抗菌的复筛

将筛选出的拮抗菌株重复上述操作，即在直径为9 cm含有15 mL PDA培养基的平板距离边缘2 cm处分别对称接种培养5 d的炭疽病原真菌和具有拮抗效果的拮抗菌株菌饼（直径5 mm），以只接种病原真菌菌株菌饼的平板作为对照。每个处理设置3次重复，25 ℃、黑暗条件下进行培养。5 d后测量病原真菌菌落半径并计算抑制率。

抑制率=（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径×100%。

2 结果与分析

2.1 炭疽病的发病症状

叶片染病时常呈黑色，形状不一。匍匐茎、叶柄感病初期出现直径3～7 mm的黑色纺锤形或椭圆形病斑，稍凹陷，蔓延后叶柄和匍匐茎折断；当匍匐茎和叶柄上的病斑扩展成为环形圈时，病斑以上部分萎蔫枯死，切断根茎，从横断面上可看到从边缘向内部扩大的红褐色坏死斑（图1），随着病情加重，则全株枯死。

2.2 病原真菌鉴定

形态学鉴定：病原真菌菌株接种至PDA培养基上培养，其菌落一般呈地毯状生长，无褶皱。形态初期菌丝为白色，培养后期菌丝逐渐由白色变灰，整齐，并产生暗黄色分生孢子堆，分生孢子两端钝圆，无色，光滑，圆柱状（图2）。鉴定结果基本符合魏景超关于刺盘孢菌属（炭疽菌）的分类标准［15］，初步表明该病原菌为炭疽菌。

分子鉴定：从草莓植株发病部位共分离纯化获得21株真菌菌株，分别命名为D1～D21。通过扩增测序，利用NCBI数据库对扩增序列进行比对，发现在草莓根部分离到11株真菌，包括6株尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum），2株F. commune，2株暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）和1株Mucor circinelloides；在茎部分离到4株C. siamense和1株F. oxysporum；在叶部分離到的5株全部是 C. siamense（图3）。

2.3 病原真菌致病性测定

通过将分离到的病原真菌回接草莓组培苗，接种6 d后，发现20株菌株能侵染草莓，其中D16（Mucor circinelloides）在草莓上不具有致病性，D1、D2、D3、D4、D6、D7、D8、D9、D11、D12、D18、D19、D20和D21共14株发病较重，D13、D14和D17发病较轻，且对照组无发病情况（图4、表2）。选取致病性较强的D8和D19这2株菌株进行叶片接种，2 d后，发病症状如图5所示，左侧为对照。通过对比观察发现，C. siamense能够在草莓上引起与田间相似的病害症状。重新对发病植株进行病原菌分离，经过测序发现与接种菌为同一真菌，根据柯赫氏法则，说明C. siamense为草莓致病菌。

2.4 拮抗菌筛选结果

将笔者所在实验室前期分离得到的29株草莓内生真菌分别与D8和D19这2株C. siamense做平板对峙试验，通过初筛，发现17株内生真菌菌株对D8和D19这2株C. siamense表现出不同程度的拮抗。通过复筛，发现Z72、Z79、Z52、Z107和Z101拮抗效果较好，抑菌率达66%～79%，其中Z72对D8和D19的抑菌率分别达到了74.07%、79.82%（图6、图7）。经鉴定，这5株拮抗内生菌均属于木霉属（Trichoderma）真菌。

3 结论与讨论

目前，国内外报道的草莓炭疽病主要是由胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）和草莓炭疽菌（C. fragariae）侵染草莓所引起的病害［16-21］。近年来，关于暹罗炭疽菌（C. siamense）侵染草莓也时有报道［22-24］。本试验对镇江丹徒区草莓产区采集的草莓植株病害样品进行组织分离，共获得21株病原真菌菌株，经致病性测定，并通过形态学和分子生物学相结合的鉴定方法，明确了镇江丹徒区草莓产区草莓炭疽病的致病菌为暹罗炭疽菌（C. siamense）。

目前草莓炭疽病仍以化學药剂防治为主，但易造成化学残留和环境污染，还会使炭疽菌的抗药性增加。据报道，多次使用多菌灵和乙霉威等化学药剂可致病原菌抗性高达90%以上［25］。利用拮抗生防菌可以规避以上问题且安全高效，利于环境的保护，已逐渐成为防治草莓炭疽病的首选措施。本试验从健康草莓植株分离获得29株内生菌，以 C. siamense 为靶标病原菌，采用平板对峙法将所得29株内生菌进行初筛和复筛，获得有拮抗作用的菌株17株，其中5株对C. siamense有较强的拮抗效果，经鉴定这5株菌株均为木霉属真菌。

已有研究表明棘孢木霉（T. asperellum） GYSW-6m1对草莓炭疽菌LC0220的抑制率高达79.03%，具有显著的防治效果［26］。毛雪琴等报道的黄蓝状菌菌株MT-06对草莓炭疽病菌的抑制率也达到了70%以上［27］。本试验通过平板对峙法筛选出的Z72对草莓炭疽病病原菌（C. siamense）的抑制率达到了76.95%。说明该菌株对草莓炭疽病菌具有良好的拮抗作用，具有一定的实际应用潜力，为进一步田间应用提供了理论支持。

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