基于网络药理学探讨川续断治疗类风湿关节炎的作用机制

喻 杨，何 吉，岑村红，支太发，黄 聪，邓 颖，罗进芳

（1.贵州中医药大学基础医学院药理学教研室，贵州 贵阳 550002；2.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550002）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵蚀性关节炎为特征的全身性慢性自身免疫性疾病，其病理改变以炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳、软骨组织损伤为特征，临床表现为关节疼痛、僵硬、肿胀，疾病进展将会导致关节畸形和正常关节功能丧失[1]。目前，本病的确切病因以及病理机制仍未明确，临床治疗主要以糖皮质激素、改善病情抗风湿药、非甾体抗炎药及生物制剂等药物对症治疗，但这些药物有许多不良反应，并且费用高昂。因此，探索RA 的有效治疗方法至关重要。中医认为RA 属于“痹症”的范畴，最早见于《黄帝内经》“风寒湿三气杂至，合而为痹”，治疗以祛风散寒除湿，通络止痛为主。川续断，又名“接骨草”，因其能“续折接骨”而得名，具有补肝肾、强筋骨、安胎、止崩漏等功效，可用于治疗腰膝酸软、风湿痹痛、崩漏、胎漏、跌扑损伤等症[2]。现代药理研究显示[3]，川续断具有保护心肌、抗骨质疏松、抗骨折、抗衰老及保护生殖系统的功能。网络药理学将系统生物学、生物信息学、化学信息学等现代医学技术结合起来，通过对中药化学成分的收集，预测潜在的作用靶点，分析与疾病相关通路，建立“中药-成分-靶点-疾病-通路”的网络，在此基础上阐明中药的作用机制。近年来，由于能够对药物、靶点、疾病的相互关系进行系统分析，使得网络药理学成为中医药研究领域一个热门课题。本研究利用网络药理学方法和分析手段探讨川续断抗类风湿关节炎的分子机制，为进一步开展川续断治疗类风湿关节炎的临床和实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 川续断活性成分及其作用靶点的筛选 从BATMAN-TCM 数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）、Herb 数据库（http://herb.ac.cn/）中检索川续断的化学成分，并结合文献报道补充喜树碱、熊果酸[4，5]等有效成分，将所获得的化合物在通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/index.php）进一步筛选，以类药性指数（drug-likeness，DL）≥0.18 为条件筛选潜在的化合物。将成分导入SwissTargetPrediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）去掉非人类靶点，进行药物成分靶点预测。

1.2 RA 相关靶点的筛选 为了获取RA 相关的治疗靶点，以“rheumatoid arthritis”为关键词，在OMIM 数据库（https://www.omim.org/）、TTD 数据库（https://db.idrblab.net/ttd/）及GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）中检索并下载整理好与RA 相关治疗靶点。

1.3 药物活性成分-RA 共同靶点的筛选 为进一步研究川续断与RA 潜在靶点之间的相互作用，将川续断主要活性成分靶点与疾病靶点输入Venn 在线工具（http://www.bioinformatics.com.cn/），取其交集，并以Venn 图的形式展示药物靶点与疾病靶点间存在的交集靶点。

1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络 将获取的交集靶点上传至String 在线平台数据库（https://cn.string-db.org/），以构建蛋白质相互作用网络模型。选择Mutiple Protein，输入共同交集基因，蛋白种属选人类，最低相互作用阈值选定为中等，将游离节点隐藏，其他参数均保持默认设置，获得PPI 网络图数据。下载PPI 网络的TSV 文件，将其导入Cytoscape 3.9.1 软件，并构建PPI 网络图。

1.5 药物活性成分-RA 靶点生物功能与通路的富集分析 为了分析关键靶点参与的生物学过程以及信号通路，将得到的交集靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行进行基因本体论（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。P＜0.05 被认为差异有统计学意义，并对筛选的结果进行可视化处理。

1.6 疾病-通路-靶点-药物网络图的构建 应用Cytoscape3.9.1 软件构建RA-通路-靶点-川续断-川续断成分网络图，并利用Cytoscape3.7.1 内置的工具对有效成分及靶点进行分析，其中包括连接度（degree）、介度（betweenness）及紧密度（closeness）等，并基于这些参数来确定核心靶点以及发挥药效的主要活性成分。

2 结果

2.1 川续断活性成分及其作用靶点的筛选 在TCMSP 数据库中根据DL≥0.18 筛选后共获得11 个活性成分（表1）。将所得成分输入SwissTargetPrediction 数据库进行药物成分靶点预测，经过筛选去重处理后共得到靶点178 个。将川续断有效成分、有效成分基因导入Cytoscape3.9.1 软件中，构建药物-成分-靶点网络图，见图1。

图1 川续断活性成分-靶点网络图

表1 川续断的主要活性成分

2.2 RA 相关靶点的筛选 在GeneCards 数据库中检索出5319 个基因，选取＞4 分的基因961 个；在OMIM 数据库中检索出42 个基因；在TTD 数据库中检索出128 个基因，共获取1131 个基因靶点，复筛去除重复值后获得1032 个基因靶点。

2.3 药物活性成分-RA 共同靶点的筛选 将川续断的活性成分和类风湿关节炎相关靶点导入Venn 在线软件，取其交集并绘制Venn 图（图2），确定了交集靶点52 个，即川续断活性成分抗类风湿关节炎作用的潜在靶点。

图2 川续断活性成分-类风湿关节炎靶点Venn 图

2.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络 为了更好地展示核心蛋白在PPI 中的调控作用，将下载的TSV格式文件导入Cytoscape3.9.1 进行可视化分析，并使用内置的Cyto NCA 分析得到最终的PPI 网络（图3）。该网络由49 个节点和263 条边组成，其中节点的大小和颜色与靶点间连线有关，连线数目多，节点越大，度值越大；节点的颜色由浅色到深色转变，对应的度值也逐渐变大。结果提示，川续断对抗RA 的靶标中介度值最高的靶点分别为VEGFA、EGFR、IL2、MMP9、STAT3、HIF1A、CYP19A1、ESR1、CYP3A4、CYP2C19，度值分别为470、222、212、199、130、114、111、104、102、101，这可能是川续断治疗RA 的关键靶点。

图3 川续断-类风湿关节炎靶点PPI 网络图

2.5 药物活性成分-RA 靶点生物功能与通路的富集分析 在GO 功能分析中，包括生物过程（biological processes，BP）、细胞组分（cellular components，CC）、分子功能（molecular functions，MF）。以P＜0.05 为依据，分别选取BP、CC、MF 中前10 的条目通过微生信平台进行数据可视化处理，结果显示川续断对RA 的治疗作用主要与平滑肌细胞增殖的正调控、细胞迁移的正调节、基因表达的负调控、细胞外间隙、细胞质、细胞质膜、内肽酶活性、酶结合、锌离子结合等相关，见图4。对54 个靶点进行KEGG 通路富集分析，筛选P＜0.05，选择富集前17 的通路为候选通路，主要涉及到癌症通路、钙离子信号通路、血脂和动脉粥样硬化通路、Ras 信号通路、Rap1 信号通路、化学致癌-受体激活通路等信号通路，见图5。

图4 GO 功能分析

图5 KEGG 通路富集分析

2.6 疾病-通路-靶点-药物网络图的构建 应用Cytoscape3.9.1 构建类风湿关节炎-通路-靶点-川续断-川续断成分网络图（图6）。使用Cytoscape3.7.1 内置的Network Analyzer 分析川续断治疗类风湿关节炎网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点。川续断治疗类风湿关节炎的核心成分为Camptothecin、hederagenin、Ursolicacid 和beta-sitosterol 等（表2），最主要靶点为EGFR、VEGFA、STAT3、FGF2、MMP9、CASP3、MMP2、MET、ESR1 等（表3）。

图6 类风湿关节炎-通路-靶点-川续断-川续断成分网络图

表2 川续断主要活性成分网络节点特征参数

表3 川续断主要活性成分靶点网络节点特征参数

3 讨论

RA 是一种以高发病率、高复发率、高伤残率为特点的慢性炎症性疾病。据报道[6]，RA 在全球的发病率为0.5%～1.0%，是成人最常见的慢性炎症性疾病之一。近年来，传统中草药对RA 的治疗效果越来越明显，越来越受到广大临床及科研工作者的关注。但是中草药的成分和作用机制还未明确，其应用受到限制。因此，探索川续断对RA 的治疗机制是十分必要的。本研究旨在运用网络药理学方法分析和研究川续断缓解RA 的作用机制，为今后的应用提供依据。

本研究通过TCMSP 数据库筛选出了11 种川续断有效活性成分，其中喜树碱（Camptothecin）、常春藤皂苷元（Hederagenin）、熊果酸（Ursolicacid）以及β-谷甾醇（Beta-sitosterol）等7 种成分符合本筛选条件的靶点富集，可能是川续断中最为重要的药效成分。Ndjateu FST 等[7]研究发现，从Barteriafistulosa中分离出来的的常春藤皂苷元对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。Choi J 等[8]研究发现，常春藤皂苷元的镇痛特性对RA 具有明显的抑制作用。熊果酸是川续断中研究比较多的一个活性成分，有研究表明[9]，熊果酸可通过核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路阻断mptp 诱导的多巴胺能神经元变性而发挥其抗炎活性。此外，熊果酸还可抑制TNF-α 诱导的p65 核转位和IκBα 和AKT的磷酸化，逆转TNF-α 诱导的P20、ACS 和NLRP3的上调，即通过NF-κB/NLRP3 炎症小体途径激活软骨细胞，起到骨保护作用[10]。另外，熊果酸还能通过诱导转录因子特异性蛋白1（Sp1）介导的Noxa 表达升高和Mcl-1 的蛋白酶体降解增强，从而促进RA 滑膜成纤维细胞凋亡[11]。现代药理学研究证实[12]，β-谷甾醇具有治疗类风湿性关节炎、免疫抑制、前列腺增生、高脂血症等多种疾病的功效。β-谷甾醇通过抑制LPS 诱导的ROS 增加来抑制炎症小体NLRP3 的激活，进而下调细胞中的IL-6、IL-8、IL-1β 和TNF-α 的表达，从而发挥抗炎作用[13]。Liu R 等[14]研究表明，β-谷甾醇通过增加γ-干扰素（interferon-γ，INF-γ）和减少白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）发挥其抗炎作用。由此推断，川续断的主要活性成分具有一定的抗炎作用，可能因此来改善RA 的症状，并为以后的研究提供了理论基础。

本研究中川续断与类风湿关节炎共同的52 个靶点，对PPI 网络进行分析，筛选出5 个关键靶点，分别是VEGFA、EGFR、MMP9、STAT3、IL-2。VEGFA与RA 中血管翳的血管生成有关，在RA 的发病机制、病理变化和治疗中发挥着重要作用。VEGFA 在滑膜巨噬细胞、微血管周围的成纤维细胞和血管平滑肌细胞中显著表达[15]。研究表明[16]，通过下调VEGFA 的表达抑制血管新生，可起到治疗RA 的作用。EGFR 是一种细胞表面蛋白，与表皮生长因子结合，从而诱导受体二聚化和酪氨酸自磷酸化，导致细胞增殖[17]。VEGFA 可与EGF、TGF-α、双向调节素（amphiregulin，AREG）、上皮细胞有丝分裂蛋白（epithelialmitogen，EPGN）等多种配体相结合并发挥多种生物学功能，促进RA 的进展[18]。基质金属蛋白酶（matrix metallopmteinases，MMPs）是一种能够降解细胞外基质的锌蛋白酶，会导致关节疼痛、肿胀、骨侵蚀和软骨破坏等加重，其中MMP9 主要与骨侵蚀有关。研究表明[19]，MMP9 能够降解细胞外基质，导致肌纤维被破坏，并会释放出炎症因子进入关节液中，从而导致关节炎的发生。STAT3 是类风湿关节炎的关键致病因子，研究显示[20]，通过抑制JNK1和STAT3 的磷酸化，可抑制JNK/STAT3 信号通路活化，从而对RA 模型大鼠的炎性损伤及骨组织病变起到保护作用。IL-2 属于一种具有代表性的炎性趋化因子，Orozco Valencia A 等[21]研究显示，IL-2 可以通过对T 辅助性细胞的分化产生影响，进而直接影响免疫反应过程。由此可见，川续断可能通过调控RA 患者的VEGFA、EGFR、MMP9、STAT3、IL-2等关键潜在靶点对免疫系统、全身炎症情况及骨侵蚀进行调节，以缓解RA 病情。

KEGG 通路富集分析显示，川续断治疗RA 涉及到Pathways in cancer、IL-17、HIF-1 及AGERAGE 等信号通路。有研究表明[22]，RA 成纤维样细胞异常增生，并展现出了类癌细胞特点，提示RA 成纤维样滑膜细胞异常增生可能与癌症相关通路有关，川续断可通过癌症相关通路对RA 发挥其治疗作用。IL-17 参与RA 患者滑膜炎的正反馈调控，高表达可导致RA 患者滑膜组织处于缺氧状态，促进血管形成，参与关节的炎症、损伤[23]。IL-17 通路具有促进炎症、血管生成和破骨细胞生成等生物学功能[24]，影响着RA 疾病的发展。HIF-1 由HIF-1α和HIF-1β 组成，HIF-1α 是低氧反应的关键调节因子之一，在骨建模、骨重塑和稳态中发挥重要作用。研究表明[25]，通过激活JAK2/STAT3 通路可促进破骨细胞分化。另有研究表明[26]，AGE-RAGE 信号通路在糖尿病及其并发症的形成与发展中有着重要作用，AGEs 可以激活RAGE，会导致轻度全身性炎症反应和氧化作用。由此推断，川续断可能是通过以上信号通路调节RA，从而发挥治疗作用。

综上所述，川续断可能通过喜树碱、常春藤皂苷元、熊果酸以及β-谷甾醇等主要活性成分，作用于VEGFA、EGFR、MMP9、STAT3、IL-2 等核心靶点，通过Pathways in cancer、HIF-1、AGE-RAGE、IL-17 等信号通路，协同发挥对RA 的治疗作用。这些结果可为川续断治疗RA 的作用机制研究提供新的思路，为今后的应用和发展奠定了理论基础。