利用生物信息学方法分析青黛治疗溃疡性结肠炎的药理作用机制

张卉青，韦卓纯，林 绘，方泽慧，张 越，仲 春，黄卫娟

（1.东莞市滨海湾中心医院临床药学科，广东 东莞 523900；2.青岛市即墨区人民医院药剂科，山东 青岛 266200；3.上海市北蔡社区卫生院药剂科，上海 200000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见的特发性炎症性肠病，其发病机制受多种因素影响，包括饮食、环境、遗传易感性、上皮屏障缺陷、免疫反应失调等[1-4]。目前临床上尚无彻底治愈UC 的方法，西医治疗以控制急性发作、黏膜修复、维持缓解、减少复发、预防并发症发生为主，治疗药物包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素类、免疫抑制剂、生物制剂等[5]。中医将UC 归为中医学“肠澼”“痢疾”“便血”等病范畴，通过辨证施治给予口服中药治疗或中药灌肠治疗[6，7]。中药青黛具有清热、解毒、凉血、定惊的功效，历代医家多用其治疗疮疡疖毒、惊厥躁动、吐血便血等症。现代临床将其用于促进皮肤黏膜愈合、溃疡性结肠炎、白血病等[8-10]。本研究采用网络药理学的研究方法，探索青黛治疗溃疡性结肠炎的药理作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 青黛相关靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库获得青黛的化学组分，根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）及类药性（drug-likeness，DL）药物代谢动力学参数进行活性成分初步筛选，以获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点，并根据已发表的文献报道补充未检测到的活性化合物的已知靶点。最后使用Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/）对化合物的蛋白质靶点名称进行统一规范。

1.2 UC 相关靶点的筛选以“Ulcerative Colitis”为关键词，在GeneCards 数据库（http://www.genecards.org/）、DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org/home/）中获取UC 相关靶点，并以DrugBank 数据库（http://www.godrugbank.com）中临床一线治疗药物的靶点为补充。合并3 个数据库得到的靶点后，删除重复值最终得到UC 潜在治疗靶点。

1.3 青黛成分-UC 靶点PPI 网络构建 利用R 语言将青黛成分相关靶点与UC 靶点取交集绘制韦恩图，获取两者共有靶点，即青黛治疗UC 的潜在作用靶点。将获得的共有靶点导入String 数据平台（http://cn.string-db.org/），生物类型设定为“Homo sapiens”，最小互作阈值设定为“Highest confidence”（＞0.9），其余选项设为默认值，得到蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图。

1.4 共有靶点GO 功能与KEGG 通路富集分析 GO对基因和蛋白质功能进行限定和描述，将基因功能分为3 个部分：细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）。KEGG 是一个整合基因组、化学和系统功能信息的数据库。将获取的共有靶点输入Metascape 数据平台（http://metascape.org/gp/index.html），设置P＜0.01，进行GO 及KEGG 富集分析，对结果进行可视化分析，得到青黛治疗UC 的生物功能和信号通路。

1.5 药物成分-靶点-通络网络图构建 运用CytoScape3.7.1 构建药物成分-靶点-通路网络图，利用CytoScape3.7.1 内置工具包分析成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度（degree）、介度（betweenness）及紧密度（closenness）等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

2 结果

2.1 青黛及UC 靶点的获取 以“青黛”为关键词检索并设置筛选条件为OB≥30%，DL≥0.18 后，最终得到其活性成分9 个（表1）。通过TCMSP 数据库筛选得到青黛有效成分的潜在作用靶点64 个。运用GeneCards 数据库设定Score≥2 倍中位数的目标靶点为UC 的潜在靶点，结合DisGeNET，DRUGBANK数据库补充，合并删除重复值后，得到1599 个UC相关靶点。

表1 青黛主要成分

2.2 青黛-UC 靶点PPI 网络构建 将获取的青黛靶点及UC 治疗靶点取交集作韦恩图（图1），得到青黛-UC 共同靶点32 个。将32 个共靶点提交至String数据库平台，得到青黛-UC 共同靶点的PPI 网络图（图2）。

图1 青黛-UC 韦恩图

2.3 靶点功能与通路富集 应用Metascape 数据平台对青黛-UC 相关靶点进行信号通路分析，并对结果进行可视化，结果显示青黛与UC 共同靶点在CC 中主要富集条目为细胞膜的膜阀（membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）和膜区（membrane region）（图3A）；共同靶点在BP 中主要富集条目为脂多糖应答（response to lipopolysaccharide）、对细菌源性分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、有毒物质反应（response to toxic substance）等（图3B）。共同靶点在MF 中主要富集条目为细胞因子受体（cytokine receptor binding）、DNA 结合转录因子（DNA-binding transcription factor binding）、血红素结合（Heme binding）等（图3C）。青黛治疗UC 主要参与的信号通路包括脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（hepatitis B）、EB 病毒感染（epstein-bar virus infection）等疾病相关信号通路（图3D），靶点通路富集结果见表2。

图3 青黛-UC 共靶点富集分析

表2 青黛治疗溃疡性结肠炎靶点通路富集结果（前20 位）

2.4 药物成分-靶点-通路网络图构建 运用CytoScape 3.7.2 构建成分-靶点-通路网络（图4），运用CytoScape 3.7.2 内置的Network Analyzer 分析青黛治疗溃疡性结肠炎的网络拓扑学参数，得到核心成分及靶点见表3、表4。

图4 药物成分-靶点-通路网络图

表3 青黛主要活性成分网络节点特征参数

表4 共靶点网络节点参数特征

3 讨论

UC 是一种病因不明，主要累及直结肠黏膜，表现为以结直肠黏膜连续性、弥漫性炎症改变为特征的慢性非特异性肠道炎症性疾病[11]。随着近年来人民生活水平的提高及饮食习惯的改变，UC 的发病率逐年增高[12]。流行病学调查发现[13，14]，我国南方（广东省中山市）发病率为2.05/10 万，北方（黑龙江省大庆市）发病率为1.64 万/10 万。以往研究表明[1-4]，UC的发病机制主要涉及环境、免疫、遗传因素、肠道粘膜屏障破坏、感染、肠道菌群失调等。其中，免疫系统中免疫细胞（CD4+T 细胞、Th17 细胞、调节性T细胞）、炎性细胞因子（TNF-α、IL）、TLR4/NF-κB 信号通路等均参与UC 的发病过程。

本研究通过网络药理学的研究方法得到青黛治疗UC 的主要活性成分、主要作用靶点及参与调控的信号通路。通过GO 及KEGG 富集分析，结果表明青黛治疗UC 的主要靶点为RELA、TNF、IKBKB、CASP3、MAPK14、CASP8 等。RELA 是NF-κB 家族的重要成员之一，NF-κB 调控细胞增殖、分化及凋亡相关基因表达，涉及肿瘤、炎症、免疫反应等众多生理和病理活动。RELA/p65 翻译修饰后能够精细地调控NF-κB 的转录激活[15-17]。IKBKB（又名IKKβ）是IKK 复合物重要的催化亚基，它与催化亚基IKKα 以及IKKγ 共同构成IKK 复合物。IKK 复合物的磷酸化可以激活NF-κB，使得NF-κB 转入细胞核内调控一系列基因表达[18]。TNF-α 是一种重要的促炎细胞因子，能够与多种细胞因子产生协同作用，进一步诱导机体中炎症介质的释放。研究表明[19]，TNF-α 水平的上调与UC 的发生、发展密切相关。丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是4 种p38 MAPK之一，可以通过紫外线照射、炎性细胞因子刺激等激活，在细胞级联反应中发挥重要作用，调节细胞的生长、分化和对环境的应激适应、炎症反应等多种病理生理过程[20]。有研究表明[21-23]，雷公藤多苷、参苓白术散、葛根芩连汤等多种中药制剂能够通过调p38 MAPK 信号通路治疗UC。Caspase 家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活或超常表达均引起细胞凋亡。有研究表明[24]，青黛可以通过调节粘膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的表达，减轻DSS 诱导的结肠黏膜损伤程度，减轻上皮细胞变性/坏死。青黛还可以显著降低DSS 诱导的巨噬细胞浸润和TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 表达，同时显著抑制LPS 诱导的TNF-α、IL-6 和COX-2 的表达，抑制IKaB-α 降解和NF-κB p65 核易位[25]。

本研究结果表明，中药青黛的有效活性成分为双靛蓝（bisindigotin）、靛苷（indican）、10h-吲哚-[3,2-b]-喹啉（10h-indolo,[3,2-b],quinoline）、异靛蓝（Isoindigo）、靛蓝（Indigo）、6-(3-氧吲哚啉-2-亚基）吲哚并[2,1-b]喹唑啉-12-酮（6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one）及靛玉红（indirubin）。通过成分-靶点-通路网络的构建与分析，有效成分靛玉红在与靶点、通路的连接度、介度及紧密度中均具有突出优势，其可能为青黛治疗溃疡性结肠炎的关键成分。靛玉红作为青黛的有效成分，已被证实其具有抗肿瘤和神经保护作用[26，27]。体外研究表明[28-30]，靛玉红对脂多糖诱导的炎症细胞具有一定的体外抗炎作用，其作用机制可能为下调IL-6/TNF-α 的表达。另研究表明[31]，靛玉红可以通过降低TGF-β1 水平，上调INF mRNA 表达，达到抑制炎症的效果，从而改善三硝基苯磺酸诱导的溃疡性结肠炎大鼠的症状、结肠病理状态。且高剂量的靛玉红通过降低TNF-α、IFN-γ 含量，增加紧密连接蛋白ZO-1 表达而发挥其改善肠上皮屏障功能，消除肠道炎症[32]。

综上所述，青黛治疗UC 的主要活性成分为靛玉红，主要通过调节RELA、TNF、IKBKB、CASP3、MAPK14、CASP8 等靶点，抑制细胞炎症反应，改善肠道上皮细胞功能，从而达到治疗UC 的目的。