紫外-可见分光光度法测定赣南风车子中总黄酮的含量

胡宏凯，彭金年，黄 纯，赖伟杭，张梦雅，程庚金生*

（1.赣南医科大学，江西赣州 341000；2.赣州市立医院，江西赣州 341000）

风车子（Combretum alfrediihance）为使君子科风车子属植物，别名水番桃、清凉树、华风车子、四角风，分布于江西、湖南、广东、广西等地[1]。风车子属植物的根、茎、叶、花和种子均可入药，在不同地区被当作民间药广泛用于治疗肝炎、痢疾、呼吸道感染甚至癌症[2,4]。现代药理研究表明该属植物具有保肝、抗炎、杀菌、抗癌和抗艾滋病等作用[2,4]，其化学成分主要以二苯乙烯类、三萜化合物及菲类化合物为主，此外还有大环内酯类、黄酮类、脂肪酸类、生物碱类和甾体类化合物等[2-7]。

黄酮类成分可能是风车子属植物的主要药效成分之一，但目前对风车子黄酮类化合物的研究相对较少，本论文拟用紫外可见分光光度法测定风车子中总黄酮的含量，建立风车子总黄酮含量比色测定的方法，为风车子的进一步开发利用奠定理论基础。

1 仪器与试剂

高速万能粉碎机（WK-1000A，上海新诺仪器设备有限公司），十万分之一电子天平（AB135-S，瑞士梅特勒有限公司），数控超声波清洗器（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司），紫外-可见分光光度计（UV2600，岛津仪器有限公司），旋转蒸发仪（N-1001，上海爱郞仪器有限公司），超纯水系统（Direct-Q 5，默克密理博有限公司）。

芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100080-201610），超纯水（自制），乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等试剂均为分析纯。风车子（市售）经赣南医学院彭金年副教授鉴定为使君子科风车子属植物风车子（Combretum alfredii hance）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品20 mg，用60 %乙醇溶解定容至100 mL，配制成0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

将风车子60 ℃烘干，用高速万能粉碎机粉碎，过40目药筛。精密称取1.000 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加入60%乙醇后，置于超声波清洗机中进行提取（料液比1:34，提取时间60分钟[8-9]），抽滤，滤渣同法再提取2次，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至适量，转移至50 mL容量瓶，以60%的乙醇定容至刻度，得风车子供试品溶液。

2.3 标准曲线绘制

精密吸取芦丁对照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分别置于50 mL容量瓶中，各加60%乙醇溶液至12 mL，分别加入5%亚硝酸钠溶液2 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液2 mL，摇匀后放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液20 mL，摇匀后放置5 min，加60%乙醇溶液至刻度，摇匀后放置15 min。

测量波长的确定：以未加芦丁对照品溶液的第1瓶溶液作空白，对加入8.0 mL芦丁对照品溶液的第5瓶溶液在350～600 nm范围内进行光谱扫描，得芦丁对照品显色后的吸收曲线；同法对风车子供试品溶液适量显色处理后扫描，得到风车子样品显色后的吸收曲线，结果见图1。对比芦丁对照品和风车子样品的吸收曲线，选择508 nm为定量测量波长[9]。

图1 芦丁对照品和风车子样品显色后的吸收曲线Fig.1 Absorption spectrum of rutin standard and Gannan Combretum alfredii samples after color development

以未加芦丁对照品溶液的第1瓶溶液作空白，在定量波长508 nm处测定各溶液的吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，线性拟合得回归方程y=8.652x-8.524E-4（R2=0.9986），线性范围0.008～0.040 mg/mL，见图2。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Rutin standard curve

2.4 风车子总黄酮含量测定

取2.2项下风车子供试品溶液0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3项下方法依次加入显色剂，在508 nm测定其吸光度，重复测定3次，以吸光度平均值根据回归方程计算风车子黄酮含量。

计算得赣南风车子样品总黄酮含量为（58.42±0.19）mg/g(n=3)。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

取芦丁对照品溶液5 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3项下方法分别加入显色剂后测定其吸光度，反复测定6次，以吸光度值计算，RSD为1.01%，表明精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

分别取芦丁对照品溶液5 mL和风车子供试品溶液2 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3项下方法分别加入显色剂后，依法分别于0、20、40、60、80、100、120 min测定，以吸光度值计算，RSD为分别为0.86%和1.98%，表明该测定方法2 h内具有良好的稳定性。

2.5.3 重现性试验

精确称量风车子粉末6份，按2.2项下方法制备风车子供试液，依2.3项下方法分别加入显色剂后，用紫外可见分光光度计测定吸光度，以吸光度值计算，RSD（n=6）为2.28%，表明该法具有良好的重现性。

2.5.4 加样回收率试验

取已测总黄酮浓度的样品溶液适量，平行进行6份试验，加入芦丁对照品适量，依2.3项下方法分别加入显色剂后测定其吸光度，根据回归方程、加样回收率计算公式，得平均加样回收率为97.74%，RSD为1.84%，表明该方法准确度良好。

3 结论与讨论

风车子中黄酮类化合物经超声提取、硝酸铝显色后，可用紫外-可见分光光度法在508 nm下定量测定。线性拟合得回归方程y=8.652x-8.524E-4（R2=0.9986），线性范围0.008～0.040 mg/mL，测得赣南风车子中黄酮含量为（58.42±0.19）mg/g(n=3)，该方法操作简便、快捷、高效、结果准确、精密度和稳定性好，杂质干扰少。风车子是江西赣南地区的特色中药材之一，开发利用风车子对促进赣南特色中药材发展具有一定的意义，本文建立了超声提取、紫外-可见分光光度法测定风车子总黄酮含量的测定方法，可为开发利用赣南风车子总黄酮提供定量分析方法。