HPLC法测定参苓白术散中三种成分的含量

刘旭明 辛蕊华 仇正英 李锦宇 刘 莲 王贵波

中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃 兰州 730050

参苓白术散，出自《太平惠民和剂局方》[1]。由人参、茯苓、炒白术、甘草、山药、炒白扁豆、莲子、炒薏苡仁、砂仁、桔梗等十味中药粉碎混合，过筛制得，具有益气、健脾、止泻的功效[2]。该处方中人参、茯苓、炒白术为君药，山药、炒白扁豆、莲子、炒薏苡仁为臣药，砂仁为佐药，桔梗、甘草为使药，可用于脾虚湿盛型泄泻、脾虚湿阻型腹泻、肺脾气虚证慢性鼻窦炎、慢性阻塞性肺疾病稳定期等的治疗[3-7]。处方中白术有“健脾补气第一要药”之称，主要有效成分是倍半萜类，包括苍术酮、白术内酯Ⅰ等，具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤等功效[8-9]。甘草苷作为甘草的主要活性成分之一，具有抗炎、抗胃溃疡活性等功效[10]。目前中华人民共和国药典和兽药典对于参苓白术散的质量标准，仅记载薄层色谱法定性鉴别，未见收载相关成分含量测定项；已有的研究主要应用HPLC法等对参苓白术散中人参的主要成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1、甘草的主要成分槲皮素和芦丁、白术的主要成分白术内酯Ⅲ、砂仁的主要成分樟脑、龙脑和乙酸龙脑酯进行了含量测定[15-18]，而对其中的苍术酮、白术内酯Ⅰ和甘草苷的含量研究鲜有报道；且市面上白术与甘草的质量差异很大[11-12]。本试验将其为切入点，用HPLC法定量测定参苓白术散中苍术酮、白术内酯Ⅰ和甘草苷的含量，以期为参苓白术散中苍术酮、白术内酯Ⅰ和甘草苷含量测定法的确立及今后药典和兽药典制订相关质量标准提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(美国 Waters 公司)；AP-01P真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，美国Agilient公司)；多功能粉碎机(永康市红太阳机电有限公司)。

1.2 材料 苍术酮标准品(CAS#6989-21-5，95%)、白术内酯Ⅰ标准品(CAS#73069-13-3，98%)均购自上海源叶生物科技有限公司，甘草苷标准品(111610-201908，95%)购自中国食品药品检定研究院，色谱纯乙腈、甲醇均购自赛默飞；分析纯磷酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司；95%乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。试验所用药材全部购自兰州安泰堂中药饮片有限公司，经中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所质量检测均合格。

2 方法与结果

2.1 苍术酮和白术内酯Ⅰ含量测定

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 标准品溶液配制 精密称取一定量苍术酮和白术内酯Ⅰ标准品粉末于5 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，配制成浓度为0.1 mg/mL的标准品溶液。

2.1.1.2 供试品溶液制备[8]称取参苓白术散粉末2.0 g，加入20 mL甲醇，密塞，称重，超声处理(功率250 W，频率50 Hz)30 min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足缺失的重量，摇匀后过滤，滤液用0.45 μm滤膜滤过即得供试品溶液。

2.1.1.3 阴性对照溶液制备 去除方剂中的白术，按2.1.1.2方法制备阴性对照溶液。

2.1.2 色谱条件[8]C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱程序见表1，柱温 25 ℃；苍术酮检测波长220 nm，白术内酯Ⅰ检测波长276 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.1.3 专属性试验 精密吸取苍术酮、白术内酯Ⅰ标准品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液，按2.1.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据。结果如图1～6所示，参苓白术散供试品溶液和苍术酮标准品、白术内酯Ⅰ标准品在相同时间出现色谱峰，阴性对照无干扰，说明该方法专属性良好。

图1 参苓白术散中苍术酮HPLC图

图2 参苓白术散中白术内酯Ⅰ HPLC图

图3 苍术酮标准品HPLC图

图4 白术内酯Ⅰ标准品HPLC图

图5 苍术酮阴性对照HPLC图

图6 白术内酯Ⅰ阴性对照HPLC图

2.1.4 线性关系考察 将2.1.1.1中苍术酮标准品溶液稀释至浓度为0.1308 mg/mL、0.0654 mg/mL、0.0327 mg/mL、0.0164 mg/mL、0.0082 mg/mL，白术内酯Ⅰ标准品溶液稀释至浓度为0.0256 mg/mL、0.0128 mg/mL、0.0064 mg/mL、0.0032 mg/mL、0.0016 mg/mL。按2.1.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据。以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果如图7、图8所示，苍术酮的回归方程为y=10000000X+62991，R2=0.9991；白术内酯Ⅰ的回归方程为y=60000000X-8055.9，R2=0.9997。说明苍术酮在0.0082～0.1308 mg/mL浓度范围内线性关系良好，白术内酯Ⅰ在0.0016～0.0256 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

图7 苍术酮标准曲线图 图8 白术内酯Ⅰ标准曲线图

2.1.5 精密度试验 精密吸取2.1.1.1项下标准品溶液，按2.1.2色谱条件进行检测，连续进样6次，记录色谱图，分析数据。计算出苍术酮、白术内酯Ⅰ的峰面积RSD值分别为0.3%、0.2%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密称定同一批样品6份，每份2.0 g，按2.1.1.2方法制备供试液，按2.1.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据。计算出苍术酮、白术内酯Ⅰ含量的RSD值分别为1.5%、0.5%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取2.1.1.2项下供试品溶液，按2.1.2色谱条件分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h进行检测，记录色谱图，分析数据。计算出苍术酮、白术内酯Ⅰ含量的RSD值分别为0.7%、1.3%，表明苍术酮、白术内酯Ⅰ在24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称定1g已知含量样品6份，精密加入浓度为0.327 mg/mL苍术酮标准品溶液1 mL，浓度为0.064 mg/mL白术内酯Ⅰ标准品溶液1 mL，按2.1.1.2方法制备供试液，按2.1.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据，计算回收率。结果见表2，苍术酮和白术内酯Ⅰ平均加样回收率分别为97.8%、103.4%，RSD值分别为0.7%、1.8%(n=6)。

表2 加样回收率测定

2.2 甘草苷含量测定

2.2.1 溶液配制

2.2.1.1 标准品溶液配制 精密称取一定量的甘草苷标准品粉末于5 mL容量瓶，加70%乙醇溶解并定容，配制成含甘草苷浓度为0.2 mg/mL的标准品溶液。

2.2.1.2 供试品溶液制备[13]精密称取参苓白术散粉末2.0 g，加入70%乙醇20 mL，密塞，称重，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再次称定重量，用70%乙醇补足缺失的重量，摇匀后过滤，滤液用0.45 μm滤膜滤过即得供试品溶液。

2.2.1.3 阴性对照溶液制备 去除方剂中甘草，按2.2.1.2方法制备阴性对照溶液。

2.2.2色谱条件[13]C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸溶液，梯度洗脱程序见表3；柱温30 ℃；检测波长237 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

表3 梯度洗脱程序

2.2.3 专属性试验 精密吸取甘草苷标准品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液，按2.2.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据。结果如图9～11所示，参苓白术散供试品溶液和甘草苷标准品在相同时间出现色谱峰，阴性对照无干扰，说明该方法专属性良好。

图9 参苓白术散HPLC图

图10 甘草苷标准品HPLC图

图11 阴性对照溶液HPLC图

2.2.4 线性关系考察 精密吸取2.2.1.1项下甘草苷标准品溶液稀释至浓度为0.2444 mg/mL、0.1222 mg/mL、0.0611 mg/mL、0.0306 mg/mL、0.0153 mg/mL，按2.2.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据。以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果如图12所示，甘草苷的回归方程为y=10000000X+16664，R2=0.9994，说明甘草苷在0.0153 ～0.2444 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

图12 甘草苷标准曲线图

2.2.5 精密度试验 精密吸取2.2.1.1项下标准品溶液，按2.2.2色谱条件进行检测，连续进样6次，记录色谱图，分析数据。计算出甘草苷峰面积RSD值为0.9%(n=6)，说明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 精密称定同一批样品6份，每份2.0 g，按2.2.1.2方法制备供试品溶液，按2.2.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据。计算出甘草苷含量的RSD值为1.3%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 精密量取2.2.1.2项下供试品溶液，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h按2.2.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据。计算出甘草苷含量的RSD值为1.8%，说明甘草苷在24 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取0.5g已知含量样品6份，精密加入浓度为0.306 mg/mL甘草苷标准品溶液1 mL，按2.2.1.2方法制备供试品溶液，按2.2.2色谱条件进行检测，记录色谱图，分析数据。结果见表4，甘草苷平均加样回收率为104.2%，RSD值为0.5%(n=6)。

表4 加样回收率测定

2.3 样品含量测定 分别取3批购自兰州安泰堂中药饮片有限公司的中药饮片，按照药典要求粉碎成细粉，过筛，混匀。取各批参苓白术散各约2.0 g，分别进样测定，计算制剂中苍术酮、白术内酯Ⅰ和甘草苷的含量。结果见表5。

表5 三批参苓白术散中苍术酮、白术内酯I和甘草苷的含量

3 讨论

HPLC法具有灵敏度高，方便快速等特点，现已被广泛运用于中药成分鉴别、含量测定等方面[14]。在参苓白术散的研究中，多数研究者利用HPLC法仅对人参皂苷Rg1、Re及Rb1进行定量分析[1，15]，个别学者应用HPLC、UPLC和气相色谱法对甘草黄酮和人参皂苷等进行了定量分析[16-18]，而对苍术酮、白术内酯Ⅰ和甘草苷的研究较少。

在对白术含量测定时，按照丁逸雪等[8]构建的色谱条件检测时所呈现的峰形对称、分离效果良好，因此直接选用该色谱条件分别考察了100%甲醇溶液、100%乙醇溶液两种溶剂的提取效果，结果发现，100%甲醇溶液作为溶剂时，检测到待测成份的含量较高，杂峰较少。此外，也考察了超声提取时间(20 min、30 min、40 min)对待测成份的影响，结果表明样品在100%甲醇溶液中超声处理30 min时，待测成份已提取完全，该方法在操作上简单易行。

在对甘草苷含量测定时，参考《中华人民共和国兽药典》甘草项检测方法色谱条件及样品处理方法，对流动相比例稍作调整用以检测样品，结果显示峰形对称、分离效果良好。在样品制备方面，本试验所用方法相对于靳雪飞构建的供试品溶液制备方法简单易行，大大节约了时间成本[19]。以改良后的色谱条件考察了70%乙醇溶液、100%乙醇溶液作为溶剂的提取效果，结果表明，70%乙醇溶液作为溶剂时，检测到待测成份的含量较高，杂峰较少；另外也考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液流动相体系洗脱效果，结果显示乙腈-0.05%磷酸溶液作为流动相时，甘草苷分离效果较好且峰形对称。

本研究成功建立了参苓白术散中苍术酮、白术内酯I和甘草苷的检测方法，且方法简单快捷、专属性强、精密度、重复性良好，将为确立和进一步完善参苓白术散中相关成分的定量分析及质量控制标准提供依据。