SPE-UPLC联用快速检测保健品中人参皂苷Rh2成分

韩璐?张杰?陈小兵?李刚?李莉?徐涛

摘 要：目的：基于固相萃取与超高液相色谱联用技术，建立一种快速准确检测保健品中人参皂苷Rh2成分的方法，为市售含有人参皂苷Rh2成分的保健品的质量评价提供参考。方法：样品预处理后经甲醇超声提取，中性氧化铝SPE小柱净化，筛选合适的洗脱剂进行HLB-SPE小柱分离纯化，采用WatersT3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱，乙腈-水为流动相梯度洗脱，PDA全波长扫描，流速0.3 mL·min-1。结果：SPE-UPLC法测得人参皂苷Rh2浓度在9.7～99.8 μg·mL-1与其峰面积线性关系良好（r=0.999），平均回收率为99.20%。结论：该方法准确、简便、快速，并能有效去除辅料干扰，稳定性高，可用于含有人参皂苷Rh2有效成分的保健食品的质量控制。

关键词：固相萃取；超高效液相色谱（UPLC）；保健食品；人参皂苷Rh2；含量测定

Rapid Determination of Ginsenoside Rh2 in Health Products by SPE-UPLC

Abstract： Objective： To establish a rapid and accurate method for the determination of rare ginsenoside Rh2 in health food products based on solid-phase extraction coupled with ultra-high liquid chromatography （UPLC）， and to provide a reference for the quality evaluation of commercially available health food products containing ginsenoside Rh2. Method： The samples were pretreated and extracted by methanol ultrasonication， purified by a neutral alumina SPE column， and screened for suitable eluents for the separation and purification on a HLB-SPE column， using a WatersT3 （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm） chromatographic column with acetonitrile-water as the mobile phase in a gradient elution， and scanned by a PDA at full wavelength at a flow rate of 0.3 mL·min-1. Result： The concentration of ginsenoside Rh2 measured by SPE-UPLC showed a good linear relationship with its peak area in the range of 9.7～99.8 μg·mL-1 （r=0.999）， and the average recovery was 99.20%. Conclusion： The method is accurate， simple， rapid and effective in removing the interference of excipients， with high stability， and can be used for the quality control of health food containing ginsenoside Rh2 active ingredient.

Keywords： solid phase extraction; ultra performance liquid chromatography （UPLC）; health food; ginseng saponin Rh2; content determination

人参是五加科植物人参的干燥根和根茎[1]，素有“百草之王”的美誉，是我国传统的天然中药材。人参主要分布于我国东北三省，俄罗斯和朝鮮境内。人参具有极高的药理活性，增强免疫力、提高记忆力、保护心肌、抗疲劳、抗肿瘤等功效[2-3]。我国最早的本草学著作《神农本草经》中就将其列为补益上品。

人参皂苷是人参的主要活性化学成分，迄今为止，从人参中分离鉴定的人参皂苷类物质已经超过100种，其中具有高活性的人参皂苷C-K、Rg3、Rh2在自然界中含量较低被称为稀缺人参皂苷[4]。人参皂苷Rh2的作用机制主要包括诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、抑制血管生成和转移等[5-8]。人参皂苷Rh2联合化疗药物可以逆转各种肿瘤细胞的耐药性，增强药物敏感性[9-11]，其作用机理和吸收代谢途径均尚在研究探索中，所以人参皂苷Rh2成分多用于中药复方制剂和人参类保健品中，导致其含量的标识规范性较差。目前多使用薄层色谱法、薄层扫描法、高效液相色谱法等方法进行含量检测，由于样品成分较复杂，分离效果较差。本文创建固相萃取与超高液相色谱联用技术，对保健品分离纯化处理，提高检测灵敏度、分离度和专属性，可用于人参类保健品中人参皂苷Rh2成分的质量评价。

固相萃取技术（Solid Phase Extraction，SPE）是一种近年来迅速发展起来的样品前处理技术，相比传统的液液萃取，固相萃取具有操作更加便捷、消除干扰能力强、目标成分筛选更快等特点。SPE兼具高富集因子和操作灵活性，具有吸收快、萃取剂可重复使用、产生三废少、分离系数好、溶剂用量少、省时等优点[12-14]。本文采用中性氧化铝填料的SPE小柱进行初步除杂，HLB新型材料填料的SPE小柱分离纯化，UPLC检测，方法准确，可靠，可用于人参类保健品中人参皂苷Rh2成分的快速检测。

1 材料与方法

1.1 仪器

NexeraX2 LC-30A UPLC（日本岛津实验器材有限公司）；KQ-800DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XS205十万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；色谱柱：Cosmosil-C18（日本半井公司）、Acquity-WatersT3（美国沃特世科技有限公司）、Phenomenex-C18（美国飞诺美公司）。

1.2 试药

人参皂苷含片（河南时珍汉方医药科技有限公司）；今幸胶囊（浙江亚克药业有限公司）；岑萃人参提取物压片糖果（江苏御臣源生物科技有限公司）；斐尔特皂苷人参复合粉（美国菲尔特制药集团）；域金方人参提取物压片糖果（广州沣芝健康食品有限公司）；人参皂苷Rh2对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111748-2005501，HPLC≥98%）；SPE-C18柱、SPE-HLB柱、SPE-中性氧化铝柱（湖北比克曼生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（默克公司），均为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为高纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 固相萃取柱预处理与加样

将SPE柱固定，加入10 mL甲醇进行活化，再次加入10 mL高纯水平衡，待液面降至SPE柱筛板表面时，注入5 mL样品溶液，控制阀门流速待样品液面降至SPE柱筛板表面时，再次缓慢注入10 mL高纯水淋洗，淋洗结束后按照洗脱剂极性大小依次淋洗，离心管收集样品洗脱液，每个极性洗脱剂收集5倍柱体积。

1.3.2 溶液的制备

（1）对照品溶液配制。精密称取适量人参皂苷Rh2对照品至10 mL棕色容量瓶并用色谱甲醇定容，配制成1.00 mg·mL-1的对照品溶液，于4 ℃避光保存备用，取适量标准溶液，以色谱级甲醇稀释成0.10 mg· mL-1、0.20 mg· mL-1、0.40 mg· mL-1、0.60 mg·mL-1、0.80 mg·mL-1不同浓度的对照品溶液。

（2）供试品溶液的配制。将统一采购的5种保健品不分剂型每品类取10份，研磨混匀，取约0.125 g，精密称定，加入色谱甲醇10 mL至25 mL容量瓶中，超声（功率460 W，频率40 kHz）溶解20 min，放冷，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀备用。将超声提取液加样至1.3.1项下预处理的中性氧化铝SPE小柱前端，先后用纯水、纯甲醇依次淋洗，净化去除保健品辅料干扰，收集甲醇淋洗剂至25 mL容量瓶中，以色谱甲醇定容，再次将中性氧化铝过滤后的甲醇溶液上样于HLB-SPE小柱前段，参照1.3.1项下操作，以85%的甲醇水溶液作为洗脱剂，洗脱HLB-SPE小柱，收集洗脱液25 mL，过0.22 μm的有机相微孔滤膜，转移至液相进样小瓶中，即得待测供试品溶液。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：WatersT3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A为乙腈，B为水；流速：0.3 mL·min-1；梯度洗脱条件：0～2.0 min，流动相A（35%～50%）；2～15 min，流动相A（50%～80%）；15～16 min，流动相A（80%～90%）；16～18 min，流动相A（90%～35%）。检测波长：PDA全波长扫描；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

1.3.4 线性关系考察

将1.3.1项下配制的0.10 mg· mL-1、0.20 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1、0.60 mg·mL-1、0.80 mg·mL-1不同浓度的对照品溶液分别进样10 μL，以被测对照品的峰面积Y为纵坐标，被测对照品的进样量X（μg）为横坐标，进行线性回归。

1.3.5 精密度实验

取中浓度对照品（0.06 mg·mL-1），按色谱条件连续进样，测定6次，连续测定5 d，记录峰面积。

1.3.6 稳定性试验

精密量取同一批供试品溶液，分别于室温下放0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、22 h、24 h进样测定，记录峰面积。

1.3.7 加标回收率

取已知含量的同一批今幸胶囊研磨后的粉末，精密称取6份，于每份样品中精密加入人参皂苷Rh2对照品溶液0.25 mL（0.80 mg·mL-1），按1.3.2项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照1.3.3项下色谱条件进样，记录峰面积，计算平均回收率。

1.3.8 样品测定

分别取5种不同品牌标识含有人参皂苷Rh2成分的保健品（n=3），分别按照1.3.2项方法制备供试品溶液，依次按1.3.3項下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品中人参皂苷Rh2的含量。

2 结果与分析

2.1 条件优化

2.1.1 色谱条件的选择

实验过程中比较了Cosmosil-C18（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Acquity-WatersT3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Phenomenex-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）3种不同孔径填料的色谱柱对分离效果的影响。结果发现Acquity-WatersT3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱分离样品的分离度、色谱峰位数量与峰形态均属最佳。

2.1.2 固相萃取柱及洗脱剂筛选

目前针对人参皂苷类成分的固相萃取柱填料一般选用大孔树脂或键合硅胶C18的反相疏水方式为主，而市售保健品一般成分复杂，对固相萃取柱填料要求较高，不仅要保证人参皂苷成分的回收率，还要将干扰成分尽可能去除。考虑市售保健品中可能存在含量较低的人参皂苷Rh2成分的样品，为使样品中人参皂苷Rh2成分得到全部洗脱，对洗脱倍数进行考察。本实验分别对C18（200 mg/3 mL）、C18（500 mg/6 mL）、HLB（500 mg/6 mL）3种不同的固相萃取柱进行筛选，同一萃取柱进行5倍柱体积洗脱，收集每次洗脱液进行UPLC检测并记录峰面积，已知峰面积与样品溶液浓度成比例，根据峰面积总和计算不同固相萃取柱的回收率情况，结果如表1所示。数据显示相同洗脱条件下，C18固相萃取柱对比HLB固相萃取柱对人参皂苷Rh2成分的保留效果较差，回收率较低，为减少待测样品因不保留造成损耗，保证高回收率，所以本实验选择HLB填料的固相萃取柱。

取适量对照品溶液上样于同一HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）前端，依次用洗脱剂洗脱多倍柱体积，收集每1倍柱体积的洗脱液进行UPLC检测并记录峰面积，计算每次洗脱液中人参皂苷Rh2的回收率，结果如表2所示。数据显示5倍柱体积洗脱后的累加回收率大于95.0%，萃取柱上人参皂苷Rh2成分残留量小于5.0%，综合考虑样品洗脱回收率，洗脱试剂用量等因素确定洗脱剂用量为5倍柱体积。结合表1实验数据最终确定固相萃取柱选用SPE-HLB（500 mg/6 mL）萃取柱，洗脱体积为5倍柱体积，相比传统填料净化能力得到提高，比较好地解决了分析干扰的情况。

在此基础上，分别用30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%浓度的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液后用100%甲醇溶液冲洗，将洗脱液与冲洗液微孔滤膜过滤转移至进样小瓶中，结果显示85%甲醇溶液回收率最高，因此确定甲醇-水（85+15）为洗脱剂。

2.2 线性关系考察

按照1.3.3项下色谱条件，将标准曲线溶液分别进样10 μL，记录不同浓度及其对应的峰面积值，计算得到线性回归方程Y=3.142×107X+8.692×103（r=0.999）；取0.10 mg·mL-1进样1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL，以S/N=3确定的检出限（Limit of Detection，LOD），以S/N=10确定的定量限（Limit of Quantitation，LOQ），最终确定LOD=0.17 μg、LOQ=0.45 μg。

2.3 精密度试验

根据系统适用性实验要求，对仪器精密度进行考察，日内精密度RSD=0.83%，日间精密度RSD=1.06%，表明该方法重复性良好。

2.4 稳定性试验

取域金方保健品适量，按1.3.2项下配制供试品溶液，在不同时间测定含量，记录峰面积，数据如表3，计算RSD=0.51%，表明24 h之内人参皂苷Rh2成分在供试品溶液内稳定。

2.5 加样回收率

按照1.3.7项下配制加样回收率待测溶液，依1.3.3项下色谱条件进样，记录峰面积，计算平均回收率为99.2%，RSD=0.42%。

2.6 樣品测定

按照1.3.8项下样品前处理进样检测，记录峰面积，并计算样品中人参皂苷Rh2的含量，见表4。今幸胶囊标示量为含人参皂苷Rh2 16.2 g/100 g，测定量为15.75 g/100 g；岑萃标示量为含人参皂苷Rh2 3.2 g/100 g，测定量为0.31 g/100 g；域金方标示量为含人参皂苷Rh2 2.0g/100 g，测定量为0.27 g/100 g；人参皂苷标示量为含人参总皂苷26.0 g/100 g，测定人参皂苷Rh2含量约为0.01 g/100 g；斐尔特未明确标示人参皂苷Rh2含量，测定人参皂苷含量约为0.03 g/100 g；考虑SPE柱损耗约为5.0%，结果表明今幸胶囊含量合格、岑萃和域金方含量不合格，人参皂苷和斐尔特两款保健品几乎不含人参皂苷Rh2成分。

3 结论

本实验采用超声提取，中性氧化铝SPE柱除杂，HLB填料的SPE小柱分离、纯化保健品中人参皂苷Rh2成分，样品前处理后通过UPLC快速检测，该方法具有操作简单、快速、稳定性高、溶剂消耗少等特点。本实验确立方法后对市售销量较高的5种标识含有人参皂苷Rh2成分的保健品进行检测，结果显示今幸胶囊含量合格、岑萃人参提取物压片糖果和域金方人参提取物压片糖果含量不达标，其余两款产品几乎不含有人参皂苷Rh2成分，综上所述本实验为含有人参皂苷Rh2的保健品质量控制提供了一种快速检测的方法。

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