基于NF-κB信号通路探讨补肾活血法治疗腰椎间盘退行性变的作用机制*

向婷,余彧,杨利学

1.陕西中医药大学第一临床医学院,陕西 咸阳 712000; 2.陕西中医药大学附属医院脊柱科,陕西 咸阳 712000

腰椎间盘退行性变(intervertebral disc degeneration,IDD)是脊柱疾病退化的常见病理基础和过程[1]。与腰椎间盘突出症、椎管狭窄、腰痛病及根性痛等脊柱退行性疾病有重大关联。这些疾病将导致患者腰痛、根性痛甚至是致残,同时也带来巨大的社会和经济负担。其中IDD是导致腰椎间盘突出的主要原因之一,其发生的病理机制大多是细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)稳态失衡,表现为基质合成代谢小于分解代谢。其主要病理学表现为髓核细胞凋亡、炎症反应、纤维环断裂及细胞外基质合成减少[2]。近年来,研究发现在IDD发病机制中,核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路扮演着重要的角色。各种刺激下NF-κB信号通路被激活,炎性细胞因子和细胞凋亡基因上调,终板软骨细胞、椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)细胞出现大量凋亡,最终导致IDD[3]。大量炎性因子在退变性椎间盘内高表达,如白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。目前,临床上手术治疗和保守治疗为IDD患者主要治疗方式[4]。研究发现益气补肾活血方干预退变性髓核细胞,不仅能够下调炎性因子的表达,而且能够减缓细胞外基质降解速度,从而延缓髓核细胞凋亡[5]。故笔者重点阐述补肾活血法基于NF-κB信号通路干预IDD的机制及疗效。

中医并无IDD相对应的名称,可将其归属于“腰腿痛”“腰痹”“痹证”范畴。“腰为肾之府”“肾藏精,主骨,生髓”。《黄帝内经》记载:“腰者,肾之府,转摇不能,肾将惫矣。”可见腰痛病位在腰,基本病机在于肾气亏虚。《医学入门》记载:“闪挫跌扑坠堕,以致血癖腰痛,日轻夜重。”《丹溪心法》云:“腰痛主湿热、肾虚、癖血、挫闪、有痰积。”后世医家认为腰痛病因在于瘀血、痰积等。因此,腰痹病机有二:一为“痹者闭也”,气血运行受阻、筋脉闭阻,出现气滞血阻,导致腰痛、腿痛等症状;二是由于营卫不通、脏腑不和,继而损伤经络,筋脉不通。因此,本病的病机总结为“气滞血瘀,筋脉闭阻”。现代医学将IDD发病原因归结为肾气亏虚为本的内在因素与急性外伤、长期劳损及风寒湿邪侵袭等外在因素。因此,腰痛基本病机以肾虚为本,不荣则痛;血瘀为标,经脉闭阻,不通则痛;本虚标实、肾虚血瘀是IDD的病理本质。治疗上应以补肾壮骨为主,重视活血化瘀,舒筋通络,二者相辅相成。现代研究显示补肾活血法通过调控炎性因子、氧化应激反应,抑制 NF-κB信号通路激活,减慢髓核细胞凋亡、细胞外基质降解速度,进而延缓IDD进程,达到缓解疼痛的效果[6]。

1 IDD病因

正常椎间盘由髓核组织和包绕其周围的纤维环以及上下软骨终板所构成,髓核组织以Ⅱ型胶原纤维(collagen type Ⅱ,colⅡ)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)为主要成分[7],正常生理状态下髓核细胞处于代谢平衡状态。IDD以髓核细胞减少及细胞外基质的降解为主要特征。近年来,越来越多的研究发现IDD病理机制主要体现在髓核细胞凋亡、基质稳态失衡以及终板软骨细胞钙化和死亡等方面[8]。IDD是一个复杂的综合过程。引发上述变化的原因与炎性因子介导的炎症反应、氧化应激反应等有关。炎性因子介导的炎症反应不仅可以激活信号通路使髓核细胞凋亡,还能上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表达,下调colⅡ和Aggrecan表达,加速椎间盘的退变。氧化应激反应促使大量活性氧自由基簇积,直接损伤髓核细胞和软骨终板细胞,扩大局部炎性反应,修饰MMPs导致细胞外基质代谢失常,最终导致IDD。

2 NF-κB信号通路

NF-κB是一个转录因子家族,在脊椎动物和果蝇中,NF-κB 家族由NF-κB蛋白和Rel蛋白两个亚家族组成异二聚体。在外界环境非刺激下,主要以p65和p50二聚体非活性形式与IKB 结合隔离于细胞质内[9]。NF-κB二聚体的活化是在衰老、炎性因子、缺氧及氧化应激等的刺激下形成的,这一过程被称为IKK介导的磷酸化诱导的IkB抑制剂降解的结果[10]。NF-κB进入细胞核并发生转录,最具代表性的是使相关促炎细胞因子基因表达。这个调控转录过程常被分为经典和非经典途径。TNF-α和IL-1信号传导的响应是NF-κB信号通路经典途径。TNF-α是典型的促炎细胞因子,其信号传导在慢性炎症疾病发病机制中发挥举足轻重的作用,比如类风湿性关节炎、炎症性肠病、哮喘和慢性阻塞性肺疾病[11]。IL-1β也是参与调节机体免疫应答和炎症反应的促炎性细胞因子,能够诱导慢性炎性疾病和急性组织损伤,包括炎症性肠病、类风湿性关节炎、各种自身免疫和自身炎症疾病等,椎间盘软骨终板细胞内炎性因子表达与IL-1β表达上调有直接关系,进而加速IDD进程[12]。

3 NF-κB信号通路与IDD的关系

NF-κB通路是某些肌肉骨骼疾病中炎症和分解代谢的主要调节通路[13]。在IDD发病过程中,可观察到NF-κB的高表达,各种刺激下激活NF-κB,调节椎间盘内多种细胞因子、趋化因子、黏附分子、炎性介质和基质降解酶的表达,从而诱发IDD[14]。近年来,许多研究证实该信号通路在IDD发病过程中的重要性,NF-κB信号通路的激活与炎性因子和氧化应激水平的升高有关。众所周知,IL-1β、TNF-α等炎性因子大量表达是IDD发生的关键,也是NF-κB信号通路激活的重要炎性因子。目前,通过诱导NF-κB信号通路加速IDD进展的机制有:(1)炎性因子激活;(2)氧化应激;(3)高糖、衰老、缺氧等。

3.1 NF-κB诱导下炎性因子对IDD的影响

3.1.1 IL-1β对IDD的影响众所周知,IL-1β是促炎性细胞因子IL-1家族中最重要的成员之一,仅存在于人体内,参与先天性炎症和免疫反应。通过刺激细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶等多种促炎介质的产生而具有较强的促炎活性[15]。退行性椎间盘组织和细胞中IL-1β高度表达[16],并已被证明IL-1β参与炎症反应、基质破坏、血管生成和神经支配、细胞凋亡、氧化应激和细胞衰老等IDD过程中的多种病理过程[17]。研究发现,IL-1β抑制NF-κB活化直接促进椎间盘内环境失稳而加速IDD[18]。因此,直接抑制IL-1β可以延缓IDD。李瑶等[19]使用NF-κB通路抑制剂 BAY11-7082 处理退变髓核细胞与正常人髓核细胞比较,发现在退变的髓核细胞中,随着IL-1β浓度的升高,ADAMTS-4和IL-1β的表达显著上调,而Aggrecan和colⅡ的表达显著降低。抑制剂BAY11-7082可以逆转这种情况。张宇等[20]通过IL-1β诱导小鼠椎间盘软骨终板细胞炎性退变,发现诱导组细胞colⅡ、Aggrecan 表达下降,col X、MMP-1、MMP-3、MMP-13、TIMP-1 表达增加,证实IL-1β诱导终板退变。

3.1.2 TNF-α对IDD的影响TNF-α是一种最有效的促炎细胞因子,大部分由单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞分泌合成[21],也可由椎间盘细胞自身产生,通过其受体TNFR1和TNFR2发出信号。TNF-α在IDD退变过程中是重要的调节因子[22]。正常椎间盘存在少量TNF-α,可以修复和重塑正常椎间盘组织[23],但TNF-α在退行性椎间盘组织中高度表达,可加速IDD的进展。目前研究证明ECM破坏、炎症反应、细胞凋亡、自噬和细胞增殖在促进IDD的发展中起关键作用[24]。NF-κB是由TNF-α激活的关键途径,并调节许多下游炎症基因的表达。Xie等[25]用TNF-α(100 μg·L-1)处理大鼠NP细胞48 h,证实炎性细胞因子TNF-α促进NP细胞凋亡,并发现TGF-β1可能有助于通过调节Fas/FasL途径,减弱TNF-β介导的NP细胞凋亡。TNF-α抑制剂(依那西普)可减少机械性痛觉异常并下调神经炎症因子[26]。但是,硬膜外注射依那西普仅是减缓神经性疼痛,对延缓IDD还存在很大争议,仍需要大量研究及随访验证。

3.2 氧化应激对IDD的影响正常椎间盘是一个缺氧、低营养且呈酸性的微环境。细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生和清除在正常情况下处于动态平衡。当以酸性pH、低营养、高渗透压和炎症为特征的退变性椎间盘[27],终板软骨的钙化供给营养物质不足以供给椎间盘内,大量微血管新生,而盘内代谢产物的清除下降[28]。机体ROS的产生与清除动态平衡失调,氧化应激反应产生。大量细胞实验及动物实验也证实ROS和氧化应激与多个骨骼肌肉疾病相关,退变性椎间盘内亦会产生大量ROS。因此,退变性椎间盘微环境致使盘内组织中簇集大量ROS。ROS在激活NF-κB信号通路中扮演重要的角色。目前认为ROS引起的氧化应激是造成细胞凋亡的触发因素也是重要原因,而当前主要的解释是ROS通过活化并诱导 NF-κB 信号表达,导致细胞凋亡。在椎间盘中,氧化应激的产物羧甲基赖氨酸可能会与晚期糖基化终产物受体结合,从而激活细胞中的NF-κB信号通路[29]。梁鹤等[30]收集正常及退变的人椎间盘组织,经生化、凝胶迁移实验及WB实验检测,结果发现氧化应激下髓核细胞通过诱导或激活NF-κB信号通路导致细胞凋亡,进而诱发IDD。杨联军等[31]采用不同浓度的过氧化氢干预氧化应激的髓核细胞模型,发现随着浓度的升高,细胞凋亡越高,ROS产生也越多,线粒体膜电位下降。李洪涛等[32]通过体外实验观察过氧化氢对大鼠髓核细胞氧化应激损伤的影响,发现过氧化氢发生氧化应激反应机制时激活髓核细胞内 p38 和 JNK 的活性,从而导致髓核细胞凋亡。

4 补肾活血法对NF-κB诱导下IDD的影响

髓核细胞数量减少和细胞外基质代谢失衡,炎性反应,细胞因子氧化应激反应是IDD的主要表现,其主要病理机制是各种刺激下激活NF-κB信号通路加速IDD。研究显示,补肾活血类中药延缓IDD的可能作用机制是减少由NF-κB信号通路活化后出现的炎性反应和氧化应激反应,从而保护髓核细胞及细胞外基质[33]。NF-κB信号通路的激活可能会加速IDD。因此,补肾活血类方能使 NF-κB 信号通路失活,通过降低炎性因子的过量表达,减缓IDD进程。

4.1 补肾活血法对髓核细胞及细胞外基质的影响椎间盘是由髓核细胞和细胞外基质组成的一个复杂整体。髓核细胞位于椎间盘内中心,是整体的主角。外界环境刺激下分泌基质成分和蛋白酶的效率不一,调节基质代谢的平衡。细胞外基质主要由Ⅱ型胶原纤维和蛋白聚糖组成,功能是使髓核维持水分,从而承受椎间盘内大量负荷。髓核细胞为盘内提供营养物质,基质维持胞内环境的相对稳定。IDD发病首先出现在髓核细胞,表现为细胞凋亡,无法发挥提供营养的作用。基质金属蛋白酶在IDD中起核心作用,主要通过分解胶原蛋白和聚集蛋白聚糖,MMPs与ECM分解和IDD进展密切相关。炎性细胞因子如IL-1β在退行性IVD中高表达,可增加MMPs的表达和相关的ECM降解。刘志超等[34]通过身痛逐瘀汤干预髓核细胞实验研究发现,髓核细胞形态及超微结构、生长状况、增殖活性优于对照组。因此,减缓IDD的作用机制可能是有效上调PI3K/AKT信号通路的表达,延缓髓核细胞的凋亡。叶辛等[35]采用补阳还五汤干预髓核细胞退变大鼠,发现补阳还五汤能够减轻细胞炎症反应,延缓细胞基质结构降解等抑制NLRP3/caspase-1信号通路激活,从而防治髓核细胞退变。王健等[36]采用补肾活血中药干预IDD大鼠,测定椎间盘组织PG和NO的含量,结果发现补肾活血法延缓IDD的机制可能是减缓细胞外基质中的Aggrecan降解、减轻炎症程度和改善局部微循环、防止自由基过量产生。

总之,IDD以细胞外基质降解失衡和髓核细胞凋亡为特点。补肾活血类方剂减缓IDD是通过降低炎性因子表达,减少基质金属蛋白酶的刺激,维持细胞外基质微环境平衡,髓核细胞正常供给等途径实现的。

4.2 补肾活血法对炎性因子的影响大量实验证实侵入退行性椎间盘中的单核细胞和巨噬细胞在退变过程中会释放大量炎性因子,如TNF-α和 IL-1β,亦是IDD启动和发展的炎性因子。研究也证实炎性因子与年龄的增长和IDD的严重程度呈正相关。因此,延缓IDD的有效方式可能是抑制椎间盘内炎性因子的过度表达。佟德民等[37]通过纤维环针刺法建立腰椎退变大鼠模型,应用身痛逐瘀汤干预,发现中药组能降低椎间盘髓核内炎性因子 TNF-α 和IL-1β的表达,发挥抗炎止痛的效果。陈和军等[38]建立兔腰椎间盘突出模型,活血祛痛汤+中药贴敷组给药4周后可以降低椎间盘组织中 IL-1α、IL-1β的含量,发挥抑制炎性反应、调节机体的免疫功能、改善局部微循环、降低血液微凝状态的功能,进而减缓IDD退变。仇湘中等[39]制备大鼠IDD模型成功后,检测出模型大鼠盘内TNF-α及NF-κB均较正常椎间盘增高,经补肝健腰方干预后,TNF-α及NF-κB表达较模型组、干预前都显著降低,证实补肝健腰方通过减少TNF-α及 NF-κB 过度表达,发挥延缓IDD的作用。方鹏飞等[40]研究发现,杜仲腰痛丸能够平衡抗炎因子IL-10和促炎因子 IL-1、TNF-α等水平的表达,抑制NF-κB信号通路的活化,从而抑制腰椎间盘突出症患者异常的炎症免疫反应。

综上所述,补肾活血法延缓IDD的作用机制可能是通过调控促炎因子和抗炎因子的平衡,进而抑制NF-κB信号通路的活化,达到减缓IDD进程的目的。

4.3 补肾活血法对终板软骨细胞的影响早期研究发现椎间盘是人体最大的无血管组织[41]。椎间盘的营养供给来源于软骨终板和纤维表面血管弥散渗透。作为椎间盘的组成部分,当软骨终板钙化或退变时,就意味椎间盘内丧失营养供给来源,从而加速IDD的进展。吕存贤等[42]通过补阳还五汤干预兔IDD模型,发现补阳还五汤对血管内皮生长因子受体的表达有促进生长作用,也能有效增加内皮细胞的增殖及血管的新生,从而恢复软骨终板区的血液再灌注,进而逆转软骨终板退变。李玲慧等[43]实验研究发现IDD与血管内皮生长因子的异常表达有关,中、高剂量补肾活血方可以下调血管内皮生长因子的过度表达,进而延缓IDD。刘汝专等[44]应用血府逐瘀汤干预IDD模型大鼠,结果发现血府逐瘀汤可降低软骨终板内IL-1β高度表达,保护椎间盘终板软骨细胞,延缓椎间盘软骨终板细胞的凋亡速度,发挥保护椎间盘的作用。苏培强等[45]采用不同浓度的 IL-1β干预兔软骨终板细胞,结果发现软骨终板细胞的凋亡与IL-1β抑制细胞增殖及基质合成有一定的关系。

因此,中药汤剂可以促进软骨终板血管再生,恢复血运再灌注,有效提供椎间盘内营养供给,进而减缓软骨终板钙化进程。

5 总结与展望

IDD是一个复杂的过程,腰痛发病率随着年龄的增长而上升,但是目前却有年轻化趋势。NF-κB信号通路在退行变疾病中有大量的理论研究,炎症是其治疗靶点,通过大量病理及临床试验对 NF-κB 信号通路的研究,反映了IDD的发病机制及补肾活血法干预NF-κB信号通路的作用机制,但目前的实验研究仍存在一些局限:(1)大量实验研究采用手术方式破坏椎间盘内结构造模,退变速度快于正常速度;(2)实验研究干预方式单纯抑制TNF-α、IL-1β某一个炎性因子,而IDD是综合因素作用下的结果,退行性腰椎间盘处于慢性炎症状态,许多促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β和 IL-6 共同参与了这一过程,这些炎性因子引起的炎性反应最终结果是引起盘内分解和合成代谢失衡,导致椎间盘退化、突出和神经根疼痛。假设仅抑制一种促炎因子很难完全阻止IDD的进展;(3)实验研究大多选用大鼠和兔的髓核细胞,虽然是研究IDD发病机制的公认模型,但与人的髓核细胞对某些刺激反应存在差异;(4)正常椎间盘内含有少量炎性因子,对髓核细胞有修复、再生、重建的功效,抑制剂阻断某一细胞因子的再生,影响髓核再生功能疗效持续时间短;(5)运用网络技术-网络药理学等解释中药的成分靶点干预某个疾病的靶点,但中药成分的复杂性很难明确阐释其影响NF-κB信号通路的具体机制,补肾活血法影响氧化应激反应方面的研究还有待深入。为此,在今后IDD的研究中,需要将中药信号通路和疾病IDD联系起来,深入探究中药干预IDD信号通路的有效成分、作用靶点、疗效机制,也为实现中医药精准治疗IDD做好充分的准备。