刘芳 高登慧 欧德渊 万文华
关键词:PKRS;组胺;肺脏病毒核酸拷贝数测定
猪蓝耳病(PRSS),又称猪流行性流产呼吸综合症,主要表现在仔猪呼吸困难和母猪繁殖障碍两个典型症状,PRRSV主要侵害猪的呼吸系统,肺脏发生典型的间质性肺炎。现今,用于检测PRRSV的方法较多,其中,实时荧光定量PCR方法能测定病毒含量和区分因污染引起的假阳性,且较普通PCR方法灵敏度高,具有较好的稳定性和可重复性,操作方法简便,同时,也减少了核酸对环境的污染,适用于样品的大批量检测,便于客观分析各实验组病毒含量的差异性,减少了由于实验操作或环境条件变化等导致的误差,使HP-PRRS患猪的肺脏病毒含量检测简便易行,且敏感度和稳定性高。
组胺是机体不可忽略的炎性因子之一,现已证实肺脏组胺受体主要是H1R和H2R,组胺能通过H1R和H2R间的相互作用,使肺微血管的通透性增加,导致肺脏微循环紊乱和病理损伤。本实验采用荧光定量PCR法检测各组仔猪肺部病毒核酸拷贝数,进一步探讨两种组胺受体拮抗剂对HP-PRRS患猪肺炎的影响,为防治该病奠定了一定的理论基础。
一、材料
高致病性蓝耳病病毒为贵州分离株GZKB株,由贵州省动物疫病研究室惠赠;荧光定量试剂盒,购自大连宝生物公司;Line-Gene荧光PCR仪(BYQ6009-107B),杭州博日科技有限公司;酶标仪(AC100-120),澳大利亚。
二、方法
(一)分组处理
30日龄三元杂交公仔猪20头购自贵州省贵阳市某养猪场,仔猪均未注射蓝耳病疫苗,体重为8.9~11kg,随机分为阴性对照组、阳性对照组、扑尔敏组和西咪替丁组,每组5头。其中,扑尔敏组、西咪替丁组、阳性组仔猪同一天肌肉注射PRRSV(10CIDso)2mL/头,并于感染病毒前1天开始,每组每天分别肌肉注射扑尔敏1.5mL/d头、西咪替丁1.5mL/头、生理盐水2mL/头,阴性对照组仔猪为每日早晚肌肉注射生理盐水2mL/头。
(二)样本处理
颈静脉放血处死人工感染病毒第10d的各组仔猪,取新鲜肺样立即放于液氮中,定量称取肺样,经定量DEPC水研磨,冷冻离心,弃沉淀留上清,用于病毒核酸拷贝数的测定。
(三)荧光定量标准曲线建立
1、标准质粒制备。用紫外分光光度计分别检测贵州省动物疫病研究室惠赠的PRRSV N基因克隆标准质粒OD和0D,计算质粒DNA溶液的浓度,同时,按照10逐级梯度稀释,梯度浓度,作为已知含量的标准模板,用于优化本实验中荧光定量PCR的反应体系和条件,建立标准曲线和检测样品核酸拷贝数。
2、实时荧光定量PCR反应条件优化。首先进行引物合成。以制备的标准品作为模板,进行SYBR Green-I实时荧光定量PCR扩增,优化反应体系中的引物浓度、退火温度等条件,最终确定该方法的最佳反应体系和条件。PCR反应体系为(需在冰上加样,总量:25μL):
3、特异性、重复性检测及标准曲线的建立。待荧光定量PCR反应条件优化好,以PRRSV N基因标准质粒为模板,进行敏感性、重复性检测,以CSF、PPV、JEV、SIV为对照,进行特异性检测,特异性条件成立后建立标准曲线。
(四)肺脏病毒核酸拷贝数测定
肺样病毒核酸反转录:与实验一的反转录方法相同,取制备好的肺样上清,以P1、P2为引物,反转录各肺样病毒RNA为cDNA。
拷贝数测定:以cDNA为模板,设立对照组,采用与建立标准曲线相同的反应条件和体系进行实时荧光定量PCR,用标准曲线计算各样品PRRSV拷贝数。
三、结果
(一)实时荧光定量PCR标准曲线的建立
l、PRRSV N基因实时荧光定量PCR反应条件的优化。取由贵州省动物疫病研究室惠赠的含PRRSV N基因的标准质粒进行实时荧光定量PCR条件优化,经优化的循环体系为:95℃预变性30s;95℃变性5s,5CC退火40s,72℃延伸50s,85℃解链引物二聚体10s,40个循环;最后72℃再延伸10rain,台阶温度为0.5℃;95℃15s,溶解曲线。
2、PRRSV N基因实时荧光定量PCR重复性、特异性检测。选择标准质粒浓度为1.0x106/μL、1.0x107/μL、1.0x10s/μL、1.0x10/μL为模板,每个浓度重复设5个样品,结果表明,相同浓度的S型扩增曲线峰值相似度高,说明N基因引物重复性好。采用相同方法检测PRRSV N基因的特异性,除PRRSV N基因能扩增出S型曲线外,对照组均未扩增出S型曲线,说明本实验建立的PRRSV N基因实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性。
3、PRRSV N基因实时荧光定量PCR标准曲线的建立。将含PRRSV N基因的标准质粒倍比稀释,采用每微升含拷贝数为1.0x10~1.0x10的模板量制定的标准曲线,线性关系较好,且相关系数为-0.997,试验数据误差小,结果见图1。
(二)仔猪肺脏PRRSV拷贝数的测定
采用实时荧光定量PCR的方法测定肺脏PRRSV拷贝数,其中阳性组含量最高,扑尔敏组、西咪替丁组显著低于阳性组(P<0.05),扑尔敏组含量最低,西咪替丁组与扑尔敏组差异不显著,结果见表1。
四、讨论
(一)关于PRRSV N基因荧光定量PCR标准曲线的建立
实时荧光定量PCR中标准曲线的制作和扩增曲线与实验结果的可靠性密切相关。本实验选用了与样品结构相似的含PRRSV N基因的标准质粒,使样品扩增效率与标准品较为接近,且本实验中标准曲线的相关系数值为0.997,较接近1,定量较准确。实时荧光定量PCR中的扩增曲线呈s型,由于反应体系中各种物质的消耗等原因,扩增曲线最终进入平台期,本实验中各组仔猪肺脏PRRSV N基因的扩增曲线指数增长期的区域重复性较好,且经优化的PRRSV N基因的荧光定量PCR方法特异性、重复性、对照性等均成立,表明使用该方法所检测的结果较准确、误差小。
(二)组胺拮抗剂对HP-PRRS患猪病毒核酸拷贝数的影响
PRRSV在猪体内分布较广,增殖速度较快,人工感染PRRSV仔猪的第2天,能在血液中检测到PRRSV,在攻毒后第10天左右增殖量最大。采用荧光定量RT-PCR法研究得出,PRRSV分布于猪的多种脏器中,其中,扁桃体、淋巴结、心脏、肾脏中含量较高,肝、脾脏、肺次之,脑组织中也能检测到病毒;人工感染PRRSV在体内的分布量与检测时间、攻毒量、猪体抵抗力等相关,本实验检测人工感染PRRSV第10天仔猪肺脏病毒核酸拷贝数,阳性组肺脏PRRSV核酸拷贝数范围与孟韩冰(2009)、方桂友(2009)等的检测结果较相似,但实验组中的扑尔敏组、西咪替丁组显著较低。
组胺通过与相应的受体结合,介导不同的病理生理作用。血管组胺受体主要为H1R和H2R,肺脏组胺受体主要也是H1R和H2R,而组胺H1R具有介导炎症反应的作用。本实验每日注射组胺H1R和H2R拮抗剂扑尔敏和西咪替丁后,发现阳性组仔猪肺脏病毒含量较实验组显著最高,扑尔敏组含量最低,且撲尔敏组肺脏损伤最轻,病理学评分均较西咪替丁、阳性组低,说明组胺H1R受体拮抗剂能拮抗炎症反应,调节机体免疫功能,减轻肺脏损伤,缓解仔猪病情,可能具有抗病毒能力。