砂引草（紫草科）大小孢子发生和雌雄配子体发育及其分类学意义

孙豪愽 孔冬瑞 胡德昌

（鲁东大学生命科学学院，烟台 264025）

砂引草属（MesserschmidiaL.）为紫草科（BoraginaceaeJuss.）的寡种属（3 种），广泛分布于亚洲温带及热带，美洲也有分布。我国有2 种1 变种，分布于北部及东南部［1］。历史上，砂引草属和紫丹属（TournefortiaL.）及天芥菜属（HeliotropiumL.）的关系一直有争议。据Diane 等［2］，林奈最早根据生活习性和果实形状描述了天芥菜亚科（Subfam.Heliotropioideae Gürke）的3 个属，天芥菜属、紫丹属和砂引草属（单型属），Gürke 于1893 年把砂引草属并入天芥菜属，Johnston 于1935 年重新恢复了砂引草属，并根据外果皮形态把紫丹属的3个种移入砂引草属。后来，Dandy［3］又逐渐把包括砂引草（M.sibiricaL.）在内的砂引草属的各个种移入ArgusiaBöhm.。因此，砂引草属就又消失了。根据ITS1 序列结合形态学资料的研究结果显示紫丹属网结在天芥菜属［2］。根据trnL 和ITS1 分子序列对天芥菜亚科的系统分析支持砂引草属位于天芥菜属［4］。Craven［5］建议把整个紫丹属并入天芥菜属。由一些学者组成的紫草目工作组（Boraginales Working Group）建立的紫草目分类系统中，也将紫丹属并入天芥菜属［6］。

分子系统的研究结果需要形态学验证。砂引草用于系统分类的形态学研究十分匮乏，仅刘家熙等［7］用电子显微镜观察了包括砂引草在内的中国产天芥菜亚科的花粉形态，发现砂引草的花粉形态和多数天芥菜属种类十分相似，花粉均为长球形，赤道面观为椭圆形，赤道部位略膨大；极面观为六裂圆形，均为三孔沟与三假沟交替排列。胚胎学特征在被子植物各个分类等级都能提供重要的信息［8］。李璐等［9］研究的藤山柳（Clematoclethra scandensMaxim.）的花药和胚珠发育特征支持其和猕猴桃属（ActinidiaLindl.）有较近的亲缘关系。Li 等［10］研究的毒药树属（SladeniaKurz）的胚胎学特征建议该属独立为科。张梓袁等［11］研究的十齿花属（DipentodonDunn）的花药和雄配子体发育特征支持将其独立为科，放在十齿花目（Dipentodontales）。Kong 等［12］研究的假海桐属（PittosporopsisCraib）的花药和胚珠发育特征支持将其从菊支Ⅰ（Asterids Ⅰ）的茶茱萸科（Icacinaceae）移入菊支Ⅱ的水螅花科（Metteniusaceae）。鉴于胚胎学特征重要的分类学意义，以砂引草为代表，对砂引草属进行胚胎学研究，并与相关类群进行比较分析，为更好地理解砂引草属的分类学位置提供胚胎学资料。

砂引草（Messerschmidia sibirica）是砂引草属多年生草本植物，广泛分布于我国北方内陆沙地和海滨砂地和蒙古、朝鲜及日本[1,13]。砂引草耐贫瘠、干旱和盐碱[14-16]，蛋白质含量高，具止血作用，是一种优良的防风固沙,饲用药用植物[17-18]。迄今为止，鲜见砂引草胚胎学方面的研究报道。本研究对砂引草大小孢子发生和雌雄配子体发育过程进行详细观察，以补充砂引草属及天芥菜亚科的胚胎学资料，并基于现有资料，比较分析其分类学意义，旨在为砂引草属的分类学位置确定提供新资料。

1 材料与方法

试验材料采自山东省烟台市芝罘区海边沙滩（37°31′35.88″N，121°26′26.73″E；凭证标本号：KONG20210425，存放于鲁东大学生命科学学院标本室）。摘取不同发育时期的花蕾和开放花朵迅速放入FAA固定液（V（50%乙醇）∶V（冰醋酸）∶V（福尔马林）=90∶6∶4）固定并保存。爱氏苏木精整体染色，常规石蜡制片技术制片，切片厚度7～9 μm。OLYMPUS 显微镜（BX-50，日本）观察，OLYMPUS数码相机（DP-72，日本）摄影。

2 结果与分析

2.1 砂引草的花药壁与小孢子发生和雄配子体发育

砂引草每个花药含有4 个花粉囊（图版Ⅰ：A）。花药壁发育早期的横切面上可观察到由孢原细胞分裂而来的初生壁细胞和初生造孢细胞（图版Ⅰ：B）。初生壁细胞平周分裂成外层和内层，外层继续平周分裂形成药室内壁和中层，而内层直接发育成绒毡层（图版Ⅰ：C～D）。初步发育成熟的花药壁由4 层细胞构成，从外向内分别是表皮、药室内壁、中层和绒毡层（图版Ⅰ：D）；根据Bhandari［19］，砂引草的花药壁发育类型属于双子叶型。绒毡层细胞发育成熟时含二核（图版Ⅰ：D）。花药壁各层随着小孢子发生和雄配子体发育的进行发生相应的变化：中层和分泌型绒毡层先后解体退化；表皮细胞拉伸成扁长形；药室内壁细胞为不规则2 层，具纤维性加厚（图版Ⅰ：E）。

来源于孢原细胞的初生造孢细胞经几次有丝分裂后行使小孢子母细胞的功能（图版Ⅰ：B～D）。小孢子母细胞减数分裂过程中，胞质分裂为同时型（图版Ⅰ：F～G），形成四面体型排列的四分体（图版Ⅰ：G）。成熟花粉为2-细胞型。（图版Ⅰ：I）。

图版Ⅰ 砂引草的小孢子发生和雄配子体发育A.花药四孢囊；B.发育中的花药壁，显示初生周缘层和初生造孢细胞；C.发育中的花药壁，箭头所指为次生周缘层分裂为药室内壁和中层；D.成熟花药壁由4层细胞组成，腺质型绒毡层细胞具2核；E.散粉前的花药壁，表皮细胞宿存，药室内壁2层，发生明显的纤维状加厚；F.小孢子母细胞减Ⅱ中期；G.小孢子母细胞减Ⅱ末期；H.小孢子四分体呈正四面体型排列；I，成熟花粉粒2-细胞型；en.药室内壁；ep.表皮；gn.生殖核；ip.次生周缘层内层；mc.小孢子造孢细胞；ml.中层；pp.初生周缘层；pm.初生造孢组织；ta.绒毡层；vn.营养核。Plate Ⅰ Microsporogenesis and male gametogenesis in M. sibirica A.Tetra-sporangial anther；B.Developing anther wall，showing the primary peripheral layer cells and the primary micro-sporogenous cells；C.Anther wall in development，indicating the endothecium and middle layer resulted from the division of the outer secondary peripheral layer（arrows indicated）；D.Developed anther wall comprised four layers，including an epidermis，one endothecium，a middle layer，and a 2-nucleated tapetum；E.Ripened anther wall including a collapsed epidermis，irregular 2-layered，fibrous thickened endothecium；F.Microspore mother cell at metaphaseⅡ；G.Microspore mother cell at telophase Ⅱ；H.Tetrahedral microspore tetrad；I.2-celled mature pollen grain；en.Endothecium；ep.Epidermis；gn.Generative nucleus；ip.Inner secondary peripheral layer；mc.Micro-sporogenous cell；ml.Middle layer；pp.Primary peripheral layer；pm.Primary micro-sporogenous tissue；ta.Tapetum；vn.Vegetative nucleus.

2.2 砂引草的胚珠解剖特征与大孢子发生和雌配子体发育

砂引草的雌蕊为两心皮合生，中轴胎座。胚珠倒生，单珠被（图版Ⅱ：A）。胚珠发育早期，表皮细胞下孢原细胞体积增大并伸长，直接发育为大孢子母细胞（图版Ⅱ：B～E）；在大孢子母细胞形成时，珠心顶端表皮细胞进行2 次平周分裂，产生4 层珠心细胞（图版Ⅱ：B～E），属于假厚珠心［20］。珠被最内层在四核胚囊时期发育为珠被绒毡层（图版Ⅱ：I～J）。到成熟胚囊时期，珠被绒毡层变得不明显（图版Ⅱ：K～L）。由于珠被顶端的延伸生长，珠孔狭长（图版Ⅱ：L）。珠心细胞从单核胚囊时期开始退化，到成熟胚囊时期，仅合点端有部分残留（图版Ⅱ：G～L）。

大孢子母细胞减数分裂形成直线形排列的4个大孢子，其中珠孔端的3个退化，合点端的1个为功能大孢子，直接转变为单核胚囊（图版Ⅱ：F～G）。随后，核进行1 次有丝分裂，形成2 个单倍体的子核；2 个核被中央液泡分开，核移向胚囊两端（图版Ⅱ：H）。2-核胚囊的2 个核再分别进行2 次有丝分裂，顺序形成4-核胚囊（图版Ⅱ：I～J）和8-核胚囊。8-核胚囊分化为成熟胚囊（图版Ⅱ：K～L）。根据Willemse 等［21］，砂引草的胚囊发育类型为蓼型。成熟胚囊梭形。卵细胞近似洋梨形。助细胞具“钩”和“喙”（图版Ⅱ：K）。反足细胞退化早。极核在受精前融合为次生核（图版Ⅱ：K～L）。

3 讨论

本研究首次观察了砂引草的大小孢子发生和雌雄配子体发育过程，结合Pal［22］和Khaleel［23］对天芥菜属其他植物的研究结果，总结了21 个砂引草和天芥菜属可比较的分类学特征（见表1），讨论了几个重要特征的分类学意义，为更好地理解砂引草属的分类学位置及亲缘关系提供了胚胎学证据。

表1 砂引草和天芥菜属胚胎学特征比较Table 1 Comparison of embryological characters between Messerschmidia sibirica and Heliotropium

3.1 砂引草小孢子发生及雄配子发育特征的分类学意义

砂引草与天芥菜属植物的小孢子发生和雄配子体发育特征基本一致，略有不同。在花药壁发育方面，二者的相同特征包括双子叶型的发育类型、表皮宿存、药室内壁细胞具纤维性加厚、分泌型绒毡层细胞含2核，不同之处在于砂引草药室内壁为不规则2层，而天芥菜属的药室内壁为1层。

在雄配子体发生和发育方面，砂引草和天芥菜属的小孢子母细胞减数分裂过程中胞质分裂皆为同时型，成熟花粉粒皆为2-细胞型［22-23］。砂引草小孢子四分体为四面体形排列。天芥菜属的H.curussavicum、H.indicum、H.ovalifolium和H.peruvianum小孢子四分体也都为四面体形排列，只有H.scabrum和H.strigosum的小孢子四分体除了四面体形，还偶有十字交叉形排列的［23］。

3.2 砂引草胚珠和胚囊发育特征的分类学意义

本研究观察到的砂引草胚珠特征与天芥菜属大部分物种十分相似，稍有不同［22-23］。砂引草胚珠为倒生，具单珠被及长珠孔，珠被绒毡层不发达，缺乏珠柄珠孔塞。天芥菜属的H.curussavicum、H.peruvianum和H.scabrum的胚珠倒生，而H.indicum、H.ovalifolium和H.strigosum的胚珠横生［22-23］。天芥菜属的H.curussavicum、H.peruvianum具有微弱的珠柄珠孔塞，但珠孔塞不是本属的典型特征，因为H.indicum、H.ovalifolium、H.scabrum和H.strigosum缺少珠柄珠孔塞［22-23］。和天芥菜属多数种一样，砂引草也没有珠柄珠孔塞。

砂引草的珠心表皮细胞平周分裂形成周缘层。根据Endress［20］，砂引草的珠心为假厚珠心胚珠。天芥菜属的H.curussavicum、H.indicum、H.ovalifolium和H.peruvianum的珠心表皮细胞和砂引草珠心表皮细胞一样进行平周分裂形成周缘层，为假厚珠心［22］。H.scabrum和H.strigosum的珠心表皮细胞不分裂，初生周缘细胞来源于孢原细胞的平周分裂，为厚珠心［23］。成熟胚囊时期，砂引草珠心组织有部分残留，这和天芥菜属的珠心组织完全退化不同［22-23］。

在胚囊发育方面，砂引草和天芥菜属植物也十分相似。相同的特征包括蓼型胚囊、成熟胚囊为梭形、助细胞具有钩和喙、极核在受精前融合等［22-23］。天芥菜属反足细胞变异较大。H.peruvianum的反足细胞在成熟胚囊时期已退化，H.strigosum的反足细胞在受精后退化，H.curussavicum、H.indicum和H.ovalifolium的反足细胞宿存最晚至8-细胞胚乳时期［22-23］。砂引草反足细胞和H.peruvianum的一样，在成熟胚囊时期已退化，没有超出天芥菜属反足细胞的变异范围。

根据现有资料比较分析，砂引草大小孢子发生和雌雄配子体发育的胚胎学特征和天芥菜属的十分相似。鉴于胚胎学特征在属内比较稳定，胚胎学证据支持分子系统中将砂引草属置于天芥菜属的处理。

图版Ⅱ 砂引草的胚珠结构、大孢子发生和雌配子体发育A.胚珠倒生，单珠被；B.大孢子孢原细胞起源于珠心表皮下；C～E.孢原细胞发育为大孢子母细胞过程中，珠心细胞平周分裂为4层（箭头所指）；F.直线型排列的大孢子四分体细胞，其中珠孔端的3个退化，合点端的为功能大孢子；G.单核胚囊；H.二核胚囊，箭头指示2个核；I～J.连续切片，显示四核胚囊，箭头指示4个核，白色虚线指示珠被绒毡层；K～L.连续切片，显示成熟胚囊及合点端残存珠心细胞；ac.大孢子孢原细胞；dtc.退化四分体细胞；fm.功能大孢子；fu.珠柄；eg.卵细胞；in.珠被；nc.珠心细胞；nu.珠心；pn.极核；sy.助细胞。Plate Ⅱ Ovule structure，mega-sporogenesis，and female gametophyte development in M. sibirica A.Unitegmic anatropous ovule；B.Archesporial cell beneath the nucellar epidermal cell；C-E.The nucellar epidermal cells divided into 4 layer（sarrows point to） when the archesporial cell developed into the megaspore mother cell；F.Linear megaspore tetrad， three micropyle tetrad cells degenerated with the functional chalaza；G.1-nuclear embryo sac；H.2-nuclear embryo sac， arrow indicates two nuclei；I-J.Serial sections，showing a 4-nuclear embryo sac with arrows indicating four nuclei，the white dotted line indicates the tapetum layer；K-L.Serial sections showing mature embryo sac and residual nucellar cells at chalaza；ac.Archesporial cell；dtc.Degenerated tetrad cell；fm.Functional megaspore；fu.Funicle；eg.Egg cell；in.Integument；nc.Nucellar cells；nu.Nucellus；pn.Polar nucleus；sy.Synergid.

致谢感谢鲁东大学菌物科学与技术研究院提供显微摄影设备。