巨峰葡萄半乳糖醛酸转移酶基因GAUT克隆及在摘心处理下的表达分析

李思雨 赖恭梯 贺丽媛 许 恒 林俊璇 郭奥琳 陈桂信 赖呈纯，

（1福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2福建省农业科学院农产品加工研究所/农业农村部亚热带特色果蔬菌加工重点实验室，福建 福州 350003）

果胶是一类复杂的细胞壁多糖，在植物生长发育的诸多方面具有重要功能［1］。果胶生物合成和修饰酶的不同组合，在不同细胞类型和不同环境条件下细胞壁重塑的可塑性和特异性等方面起着关键作用［2］，可调节细胞生长［3］，从而影响组织器官生长发育。有研究表明，果胶含量和形态能影响芍药茎的直立或弯曲［4］，亚麻茎干果胶含量降低时纤维强度增加［5］，果胶含量丰富的植物叶片吸收水分速度较快［6］，在植物的幼嫩叶片中果胶含量明显高于衰老叶片［7］，这表明果胶在植物茎、叶生长过程中有重要的调控作用。半乳糖醛酸转移酶（galacturonosyltransferase，GAUT）是果胶生物合成的关键酶，将半乳糖醛酸转移到果胶多糖上，合成聚半乳糖醛酸（homogalacturonan）。聚半乳糖醛酸属于糖基转移酶家族8（glycosyltransferases 8，GT8），是一种α-1，4-半乳糖醛酸转移酶（α-1，4-galacturonosyltransferase，GalAT），GAUT表达变化能够影响植物果胶积累，从而调节植株生长发育［8］。在拟南芥中过表达GhGATL2、GhGATL9、GhGATL12和GhGATL15，发现其果胶含量增加；而在棉花中沉默GhGATL15发现果胶含量减少，并引起表型差异［9］。Fan 等［10］发现GAUTs可能影响棉纤维的伸长和增厚，Orfila 等［11］发现拟南芥qua1-1突变体花序茎中半乳糖醛酸转移酶的活性下降。由此可见，GAUTs影响果胶生物合成，在植物茎和叶等组织器官生长发育中起着重要作用。

葡萄（Vitisvinifera）属于木质藤本果树，是我国五大水果之一，在我国广泛栽培。葡萄茎和叶片对植株生长和物质运输有重要作用，在自然状态下，葡萄主梢和副梢无差别生长，会导致营养生长与生殖生长不平衡。摘心处理是葡萄控产提质的重要栽培措施，可控制葡萄新梢徒长及促进分枝形成，并改变营养运输方向，使葡萄树体的营养更多地由顶端运输到其他生长点器官［12］。福建省农业科学院农产品加工研究所营养科学与工程研究室前期发现，摘心处理能抑制茎增粗和叶片生长［12］，结合前人研究发现果胶作为细胞壁的重要结构组分，参与植物组织和器官生长发育，推测摘心可能通过调控果胶合成相关基因表达，改变果胶生物合成从而影响茎和叶片的生长。为探究摘心处理下茎和叶片中果胶生物合成的分子机制，本试验以巨峰葡萄为材料，进行半乳糖醛酸转移酶GAUTs基因的克隆，对基因序列特征及功能进行预测分析，并分析摘心处理下巨峰葡萄茎和叶片中VvGAUTs基因的表达量变化，以期为深入探究摘心抑制茎增粗与叶片生长的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以种植于福建省福安市溪柄镇葡萄示范基地的10 年生巨峰葡萄为试验材料，树形为自然伞形，株行距1.5 m×2.6 m，每公顷种植约2 550 株。分别进行花序上留2 叶摘心和留6 叶摘心的处理，以不摘心为对照，选取摘心处理后的0、10、20、60 和120 d 的茎和叶片储存于干冰保温盒，转运至实验室立即浸没于液氮中速冻后于-80 ℃冰箱中保存备用。叶片及茎段的选取参照文献［12］，叶片取基部向上第3 叶的叶片，茎段取基部向上第2 至第3 叶节间茎段，每次随机取10 个叶片和10条茎段，设3次重复。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 按照RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）的操作步骤对巨峰葡萄新芽进行总RNA提取。基因克隆的cDNA模板制备采用EasyScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMixs试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司）。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）的cDNA 模板制备采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

1.2.2VvGAUTs基因克隆与序列分析 在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中检索获得1个酿酒葡萄GAUT基因和3 个河岸葡萄GAUT基因，其登录号分别为XM_002269146.3、XM_034818285.1、XM_002281622.4 和XM_002271260.3，以上述4 个GAUT基因序列为模板设计克隆引物，引物信息见表1。以巨峰葡萄的cDNA 为模板进行PCR 扩增。PCR 反应体系共50 μL：HS 2× Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 补充至50 μL。PCR 扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳得到目的条带，回收目的条带，连接pLB Vector 载体，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞。经抗性筛选、PCR 鉴定得到阳性克隆菌液，送至北京擎科生物科技股份有限公司测序，获得目的条带序列。利用DNAMAN 6.0软件对基因序列进行分析，使用Ensembl网站（http：//plants.ensembl.org/index.html）下载VvGAUTs基因注释文件，用TBtools v1.116软件进行基因结构绘制。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 VvGAUTs 蛋白理化特性分析 使用Expasy（http：//web.expasy.org/）预测蛋白序列的分子质量、亲疏水性和等电点等理化性质。利用Plant-mPLoc 网站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行蛋白质亚细胞定位预测。利用HMMER 网站（https：//plants.ensembl.org/hmmer/index.html）进行蛋白序列的信号肽预测。使用MEME 在线软件（http：//memesuite.org/tools/meme）分析基因编码蛋白的保守基序。

1.2.4 启动子顺式作用元件预测 通过NCBI在线网址提取VvGAUTs基因的启动子区域序列，利用PlanCARE在线网址（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）检索VvGAUTs基因的顺式作用元件，并对其进行比较分析。

1.2.5 染色体定位和多物种共线性分析 从Ensembl网站下载葡萄（Vitisvinifera）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、毛果杨（Populustrichocarpa）和水稻（Oryza sativa）的相关基因组数据文件，通过TBtools v1.116 软件绘制VvGAUTs基因的染色体定位图以及构建其与多物种间的共线性关系图谱。

1.2.6 物种间系统发育分析 用巨峰葡萄VvGAUTs蛋白序列于NCBI在线网站上进行比对，获得VvGAUTs与其他物种同源性大于70%的蛋白序列，使用MEGA 11.0软件邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育进化树，bootstrap值设为1 000，其他参数为默认值。

1.2.7 蛋白互作网络预测 利用String 在线软件（https：//cn.string-db.org/）构建VvGAUTs 的蛋白互作网络模型，设置置信度为0.4，预测蛋白个数少于10个，探究VvGAUTs 与植物细胞中其他基因的编码蛋白的互作关系。

1.2.8 qRT-PCR 分析 以经过筛选优化的clathrinadaptor complex subunit mu（AP-2）作为巨峰葡萄茎的内参基因，SAND family protein（SAND）作为巨峰葡萄叶片的内参基因，PCR 扩增采用前期研究优化后的运行参数［13］，在LightCycler®480Ⅱ 实时荧光定量PCR 仪（Roche，瑞士）上进行，设3 次重复试验。扩增结束后，利用LightCycler®480 Software Version 1.5 进行Cp 值（crossing point）和熔解曲线分析，采用2-ΔΔCt法进行目的基因表达水平的计算。测定相关基因在不同摘心处理下巨峰葡萄茎和叶片中的相对表达量，目的基因和内参基因引物信息见表1。

1.3 数据分析

使用Microsoft®Excel 2019 和SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析，用GraphPad Prism 9软件作图。

2 结果与分析

2.1 VvGAUTs基因的克隆与序列分析

以巨峰葡萄cDNA 为模板进行PCR 扩增，克隆得到4 条VvGAUTs基因序列，与预估目的片段长度一致（图1-A），测序结果与NCBI葡萄基因组数据库相应基因片段相似性均达到98%以上，分别命名为VvGAUT1a（登录号OQ718918.1）、VvGAUT1b（登录号OQ718919.1）、VvGAUT3（登录号OQ718920.1）、VvGAUT4a（登录号OQ718921.1），开放阅读框（open reading frame，ORF）序列长度分别为1 056、1 167、1 038 和1 071 bp，分别编码351、388、345 和356 个氨基酸。与葡萄基因组数据库中相应基因的DNA序列对比发现，VvGAUT1a包含5 个外显子和4 个内含子，VvGAUT1b只有2 个外显子和1 个内含子，VvGAUT3和VvGAUT4a均有3 个外显子和2个内含子（图1-B）。

图1 VvGAUTs的PCR扩增电泳图（A）和基因结构（B）Fig.1 PCR amplification electrophoretic diagram（A） and gene structure（B） of VvGAUTs

2.2 VvGAUTs基因编码蛋白理化特性分析

蛋白质理化特性预测信息见表2，VvGAUT1a、VvGAUT1b、VvGAUT3 和VvGAUT4a 的分子量分别为39.281 9、43.272 3、39.252 3 和40.427 4 kDa，等电点分别为6.16、5.39、9.10和9.05。蛋白质的稳定性预测显示，VvGAUT1a为稳定蛋白，VvGAUT1b、VvGAUT3和VvGAUT4a 属于不稳定蛋白。信号肽预测结果显示，VvGAUT1b 无明显信号肽，而VvGAUT1a、VvGAUT3 和VvGAUT4a 均含信号肽。从亚细胞定位预测结果得知，VvGAUT1a 定位在叶绿体上，VvGAUT1b 定位于细胞膜、线粒体和细胞核，VvGAUT3 和VvGAUT4a 均定位于叶绿体与细胞核。保守基序预测显示，VvGAUTs包含相同数量和类型的Motifs，4 个VvGAUTs 都有8 个保守基序（图2）。

图2 VvGAUTs蛋白的基序（A）和基序序列（B）Fig.2 The protein motifs（A） and motif sequences（B） of VvGAUTs

表2 VvGAUTs的蛋白质理化特性Table 2 Protein physicochemical properties of VvGAUTs

2.3 VvGAUTs蛋白互作网络分析

为了探究VvGAUTs 与其他蛋白在植物体中的联合作用机制，对克隆到的4 个VvGAUTs的编码蛋白的互作蛋白进行了预测（图3）。结果显示，VvGAUT1a与纤维素合成酶、漆酶和糖基转移酶等蛋白存在相互作用关系，这些互作蛋白主要参与细胞壁中纤维素合成、木质素降解以及调节代谢的速率、方向等生命活动。与VvGAUT1b 存在相互作用的蛋白主要为β-葡萄糖苷酶、UDP-糖基转移酶、组蛋白赖氨酸甲基转移酶、组氨酸激酶和果胶酯酶等蛋白，这些蛋白主要参与糖代谢、植物细胞分化、叶片衰老调控和果胶代谢。VvGAUT3、VvGAUT4a 的互作蛋白大多与细胞信号传导、细胞分裂和染色质修饰等生物过程有关。

图3 VvGAUTs的蛋白互作网络Fig.3 Protein-protein interaction network of VvGAUTs

2.4 VvGAUTs系统发育分析

为探究VvGAUTs与其他物种间的亲缘关系，以4个巨峰葡萄VvGAUTs 为查询序列，利用NCBI 数据库的Blast 工具进行比对分析并下载同源性高于70%的其他物种GAUT 蛋白序列。使用MEGA 软件构建系统发育进化树（图4）。结果显示，GAUT1蛋白聚为一大类，而GAUT3和GAUT4聚为另一大类，并且GAUT3和GAUT4又分别聚成2个亚类，表明GAUT3和GAUT4蛋白有较近的进化关系。进一步分析发现，巨峰葡萄VvGAUT1a、VvGAUT1b 均与河岸葡萄（Vitisriparia）的GAUT1 亲缘关系最近。VvGAUT3 也与河岸葡萄VrGAUT3 最先聚类合并，表明两者间亲缘关系最近，其次是与大麻（Cannabissativa）的GAUT3属于同一分支，亲缘关系较近。VvGAUT4a 与河岸葡萄VrGAUT4 的亲缘关系最近，其次是与罂粟（Papaversomniferum）的GAUT4 表现出较近的亲缘关系。

图4 VvGUATs和其他物种GUATs系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree for VvGUATs and GUATs from some other plant species

2.5 VvGAUTs染色体定位和多物种共线性分析

从Ensembl 在线软件得到葡萄基因组序列及染色体位置信息，克隆得到的VvGAUTs基因序列均被定位到不同染色体上，分别为染色体4号、18号、1号和7 号（图5-A）。以葡萄、水稻、拟南芥和毛果杨的基因组数据为参考，4个VvGAUTs基因与不同物种的共线分析发现，VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT4a与其他物种的共线基因为13个，但VvGAUT4a显示与水稻、拟南芥和毛果杨无共线基因，说明该基因具有物种特异性（图5-B）。VvGAUT1a和毛果杨有4个共线基因，和拟南芥有1个共线基因。VvGAUT1b与毛果杨有4 个共线基因，与拟南芥有2 个共线基因。VvGAUT3在毛果杨染色体8 号和10号上各有1个共线基因。因此，巨峰葡萄GAUT基因与木本毛果杨的共线性高于草本的水稻和拟南芥。

图5 VvGAUTs染色体定位（A）和多物种共线性（B）Fig.5 Chromosome localization（A） and multispecies collinearity analysis（B） of VvGAUTs

2.6 VvGAUTs基因的启动子顺式作用元件分析

顺式作用元件分析结果表明，VvGAUTs具有光响应、厌氧感应、赤霉素响应、脱落酸响应和茉莉酸甲酯响应等多种与植物生长发育相关的顺式作用元件（图6）。4个VvGAUTs基因均含有光响应的顺式作用元件，其中VvGAUT3的光响应作用元件个数最多，而VvGAUT1a和VvGAUT4a的数量基本相等。VvGAUT1a除了响应光的顺式作用元件外，还含有较多的激素响应、防御和胁迫响应与分生组织表达等作用元件；VvGAUT1b响应的顺式作用元件类型与VvGAUT1a相似，但VvGAUT1b还含有种子特异性调节的顺式作用元件；VvGAUT3只响应了光、厌氧、赤霉素和脱落酸的顺式作用元件；VvGAUT4a响应光、干旱、赤霉素、防御和胁迫、分生组织表达、水杨酸和厌氧感应的顺式作用元件。

图6 VvGAUTs的启动子顺式作用元件Fig.6 Identified cis-acting elements in promoters of VvGAUTs

2.7 不同摘心处理下巨峰葡萄GAUTs基因的表达分析

2.7.1VvGAUTs基因在巨峰葡萄茎中的表达模式分析 分析VvGAUTs在巨峰葡萄不同摘心处理下茎中的表达模式，不同生长发育阶段下4 个VvGAUTs基因成员的表达模式见图7，2 叶摘心处理下，VvGAUTs基因在茎中的相对表达量总体低于其他两种摘心处理。VvGAUT1a在不同处理下的表达量均呈先升后降的模式，在10 d时均达到表达高峰，并且在生长后期处于较低水平，其中摘心处理的表达模式总体低于不摘心处理。VvGAUT1b和VvGAUT3在不摘心和6 叶摘心下呈先升后降的表达模式，并在生长后期处于低表达水平，2 个基因的表达水平分别于10 和20 d 达到表达峰值；而2 叶摘心处理下，VvGAUT1b和VvGAUT3均处于低表达水平，且低于不摘心和6 叶摘心。VvGAUT4a在2 叶摘心处理和不摘心处理下的表达模式基本一致，均呈现较低的水平；而在6 叶摘心处理下，其表达模式在生长前期呈“降-升-降”的趋势，而在60 d 后呈现出急剧上升的状态。总体上，与对照相比，2 叶摘心处理抑制了VvGAUTs基因在茎中的表达。此外，从叶片生长过程看，VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3在叶片生长前期表达水平较高，后期表达水平较低，而VvGAUT4a呈现相反的趋势。

图7 VvGAUTs基因在不同发育阶段时不同摘心处理下茎中的表达量Fig.7 The expression of VvGAUTs in stems at different developmental stages after pinching

2.7.2VvGAUTs基因在巨峰葡萄叶片中的表达模式分析 对不同摘心处理后巨峰葡萄叶片中VvGAUTs的表达量进行分析，不同生长发育阶段下4个VvGAUTs基因在叶片中的表达量差异见图8。VvGAUT1a在2 叶摘心处理下的表达呈现下降趋势，6叶摘心处理和不摘心处理下生长前期的表达呈现相反的趋势，6叶摘心处理下10 d时具有表达高峰，而不摘心处理下10 d时的表达量最低。VvGAUT1b在2叶摘心处理下的表达总体高于其他两种处理，6叶摘心处理和不摘心处理下的表达均为先升后降的模式，其后趋于平缓。VvGAUT3在不摘心处理和6叶摘心处理下的表达均呈现下降的趋势，而2叶摘心处理下呈现“降-升-降”的表达模式，且比其他两种处理具有更高的表达水平。VvGAUT4a在2叶摘心处理下的表达量总体高于其他两种处理，不摘心处理和6叶摘心处理下的表达总体表现出相似的模式，但不摘心处理下叶片生长时期为20 d时表达量最高，而此时6叶摘心处理下叶片中该基因的表达量最低，2叶摘心处理下的表达呈现“升-降-升”的趋势，且表达量高于其他两种处理。总体上，在巨峰葡萄叶片生长前期，2叶摘心处理促进4个VvGAUTs基因表达，而在叶片生长后期抑制其表达，虽然不同基因间存在时间上的差异，但整体趋势相同。此外，从叶片生长过程看，VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3在叶片生长前期表达水平较高，后期表达水平较低，而VvGAUT4a表达水平变化较平缓。

图8 VvGAUTs基因在不同发育阶段时不同摘心处理下叶片中的表达量Fig.8 The expression of VvGAUTs in leaves at different developmental stages after pinching

3 讨论

基因结构的多样性是深入了解研究物种的进化过程的重要途径，对了解植物物种之间多样化的结构或功能关系具有重要意义［14-15］。通过对克隆到的4 个VvGAUTs进行基因结构分析发现，VvGAUT1a基因有5个外显子，VvGAUT1b基因的外显子有2 个，而VvGAUT3和VvGAUT4a基因均有3 个外显子。系统进化树分析发现，VvGAUTs和VrGAUTs的亲缘关系最近，其中VvGAUT1a和VvGAUT1b也具有较近的亲缘关系。根据系统发育保守假说，亲缘关系越近的物种在进化史上的分歧时间越短［16-17］，因此推测同一组群的VvGAUTs基因具有相同或者相似的生物学特性，其对植物的生长发育调节可能具有相同或相似的作用特征。摘心处理不仅会改变葡萄植株体内激素水平，也会形成机械损伤胁迫，4 个VvGAUTs启动子顺式作用元件分析发现VvGAUT1a、VvGAUT4a具有防御与胁迫响应元件，VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3具有脱落酸响应元件，4 个基因更是都含有赤霉素响应元件，推测摘心处理通过这些响应元件调控VvGAUTs基因的表达。

蛋白质在动植物的营养运输和生殖生长等生命活动中具有重要的调节作用，对细胞的形态发生和功能至关重要［18-19］。植物在进行各类生命活动时往往需要多种蛋白质联合进行功能的行使及应用。从蛋白互作预测结果可以发现，VvGAUTs基因的编码蛋白和纤维素、木质素和糖代谢等蛋白互作，这与前人研究结论相似，果胶能与其他细胞壁组成成分联合以保证细胞壁的伸缩灵活性，从而维持植株的正常生命活动［20-22］。前人研究发现，楸树中GAUTs基因和纤维素合成通路上的植物多肽信号基因（CLAVATA3/Embryo surrounding region-related，CLE）、葡糖苷酶基因（β-glucosidase，BGLU）共同调节树木的拉伸应力［23］；果胶合成关键基因的缺失会导致纤维素合成酶基因（cellulose synthase，CesA）的表达受到抑制［24］；半乳糖醛酸转移酶基因通过调节细胞壁重塑，从而调控叶片的大小［25］。因此，推测VvGAUTs基因通过对葡萄茎和叶片细胞壁的调控，进而影响茎和叶片的生长发育。

果胶是维持植物细胞壁结构和功能完整的不可缺少的一类聚合物，存在于细胞壁中的果胶在保护细胞对膨胀压力的反应中起着至关重要的作用，从而影响着植物的形态与功能［26］。摘心处理对果树和农作物均具有积极的作用，平衡营养生长与生殖生长，促进营养物质向花果等营养器官输送［27-28］。本课题组前期研究发现，2 叶摘心处理显著提高单果质量、果穗质量和株产量，显著提高果实产量；进一步研究发现摘心处理下的巨峰葡萄茎的粗度比不摘心茎的粗度小，且摘心处理下葡萄茎的木质化程度更深，摘心处理下的巨峰葡萄叶片比不摘心处理的叶片更小［12］。2叶摘心处理下巨峰葡萄的茎木质化，可能与VvGAUTs基因的相对表达量低，果胶合成受到一定抑制有关，这与Westermark等［29］通过测定云杉木质化样品中果胶组成成分半乳糖醛酸和鼠李糖含量，发现其复合胞间层中果胶残留较少的结论相似。2 叶摘心处理下巨峰葡萄叶片相对较小，4 个VvGAUTs基因在叶片生长前期的相对表达量明显增强，这与Biswal等［30］在杨树中发现，GAUT12.1基因的表达水平与株系叶面积呈负相关的结果相近。以上均证明了葡萄摘心处理可以通过调控VvGAUTs的表达影响果胶合成，但不同的VvGAUT基因在巨峰葡萄生长的不同时期，表达量变化存在明显的差异，其对巨峰葡萄果胶生物合成和含量的影响程度，还有待进一步的深入研究。

4 结论

本研究成功从巨峰葡萄中克隆出4 个半乳糖醛酸转移酶基因，分别为VvGAUT1a、VvGAUT1b、VvGAUT3、VvGAUT4a，编码351、388、345和356个氨基酸。VvGAUTs与河岸葡萄VrGAUTs 的亲缘关系最近。VvGAUTs 与纤维素、木质素和糖代谢等基因的编码蛋白密切互作。总体上，在巨峰葡萄2 叶摘心处理下的茎中VvGAUTs基因表达受到抑制，而VvGAUTs基因在叶片中的表达呈现生长前期表达量增强，在生长后期表达量受到抑制的趋势，表明VvGAUTs基因可以响应葡萄摘心处理。