Co-γ射线辐照灭菌对牡丹皮质量影响的多元评价研究

毛腾霄 黄春燕 伍欣然 张 良 陈 红 何 江 黄 敏

（1成都市药品检验研究院化学药品质量研究与控制重点实验室，四川 成都 610045；2四川省原子能研究院辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都 610101）

牡丹皮，别名丹皮、木芍药、洛阳花，为毛莨科植物牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr.）的干燥根皮，具有清热凉血、活血化瘀功能，为《中华人民共和国药典2020 年版 一部》［1］收载品种。牡丹皮的产地分布于安徽、重庆、山东［2］、四川和陕西［3］等地。现代药理研究表明，牡丹皮的药效成分丹皮酚具有降温、镇痛及抗动脉粥样硬化等作用［4-5］，其水提物具有抑菌作用［6］。牡丹皮质量常用的评价方法有形态学方法［7］、微性状观察法、多指标性成分测定法［8］和指纹图谱对比法［9］等。

中药材在流通过程中储藏不当易受微生物污染［10-11］。60Co-γ辐照灭菌是近年来发展起来的一种新的灭菌方法［12］，属于非热杀菌技术，具有穿透力强、消毒均匀、快速简单等特点［13］，常用于中药材或中成药灭菌处理［14］。我国对辐照灭菌有相关规定，原中华人民共和国卫生部于1997 年发布的《60Co 辐照中药灭菌剂量标准（内部试行）》（卫药发［1997］第38号）［15］规定中药原料粉辐照的最大吸收剂量不得大于6 kGy，国家食品药品监督管理总局通告《中药辐照灭菌技术指导原则》（2015年第86号）［16］规定中药最大总体平均辐照剂量原则上不超过10 kGy。

牡丹皮是中药材的一个单品，因此属于允许辐照的对象。前期调研显示，成都地区一些药品生产企业在对药材进行60Co-γ 辐照灭菌时往往超吸收剂量照射，一般为10～15 kGy，个别品种可达30 kGy。辐照后的药材，如果仍达不到卫生标准，会再次照射［17］。

60Co-γ 辐照灭菌对牡丹皮化学成分的影响已有报道。如陈小坚［18］采用分光光度法测定丹皮酚含量，经10 kGy 吸收剂量辐照后含量无变化。范铁林等［19］研究发现，经10 kGy 吸收剂量辐照后的丹皮酚含量基本不变。李跃辉等［20］采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定了6 kGy吸收剂量辐照后牡丹皮中丹皮酚和芍药苷含量，认为辐照对其无影响。上述研究仅对牡丹皮1～2种化学成分进行了考察，缺乏系统性，且剂量设置也远低于当前企业普遍采用剂量。鉴于此，本研究以牡丹皮为研究对象，通过考察不同吸收剂量60Co-γ 辐照前后微生物负载、HPLC 指纹图谱、抑菌活性和近红外光谱变化来评价60Co-γ 辐照灭菌对牡丹皮质量的影响，旨在为其质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20 批牡丹皮药材样品购自于成都荷花池中药材市场，产地为重庆市垫江县，经成都市药品检验研究院中药材质量监测评价重点试验室鉴定后备用。

金黄色葡萄球菌［CMCC（B） 26003］，中国食品药品检定研究院（北京）；甲醇（色谱纯）和甲酸，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；自配抗生素检定用培养基Ⅰ（胨5 g、牛肉浸出粉3 g、磷酸氢二钾3 g、琼脂15 g、水1 000 mL，灭菌后备用，终pH值7.9）；胰酪大豆胨液体培养基（批号：200224-21），北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters 2695 液相色谱仪，沃特世科技（上海）有限公司；MATRIX-F 在线傅立叶变换近红外光谱仪，布鲁克（北京）科技有限公司；ZY-300Ⅳ多功能微生物自动测量分析仪，北京先驱威锋技术开发公司；GHP9270隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Rotavapor R-3旋转蒸发仪，瑞士BUCHI；AEG 220电子天平（精度：万分之一），岛津（上海）实验器材有限公司；FSJ-A05N6高速粉碎机，佛山市小熊厨房电器有限公司；Waters 色谱柱（×Bridge C18 5 μm 4.6×250 mm Colum），沃特世（科技）上海有限公司；MNT919102 游标卡尺，德国美耐特。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 分别取牡丹皮样品，经高速粉碎机粉碎后，过60目筛，收集筛出的粉末，全部混匀后用聚乙烯（polyethylene，PE）无菌自封袋分装，每批5 袋，每袋100 g。

1.3.2 样品辐照（60Co-γ） 辐照在四川省辐照中心进行，吸收剂量分别设置为0（未辐照）、5、10、20 和30 kGy。辐照完成后30 d内完成各项检测。

1.3.3 微生物限度检查 经预试验选取需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及耐胆盐革兰阴性菌数超过《美国药典》（USP-NF2023）［21］相关限量值的3批牡丹皮样品，分别取其0、5、10、20和30 kGy 5个吸收剂量的样品，按照《中华人民共和国药典 2020 年版 四部》［22］1108 中药饮片微生物限度检查法检查上述项目，检查前需按要求进行方法适用性试验。

1.3.4 HPLC 指纹图谱采集 样品溶液的制备：随机选取3 批微生物检查结果未超限值（《美国药典》USPNF2023）［21］的正常牡丹皮样品，分别取其0、5、10、20和30 kGy 吸收剂量的样品，进行以下操作。精密称取供试品0.5 g 置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稳定重量，超声处理30 min，放冷，再称重并用70%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL 置于10 mL 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，即得。色谱条件：流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，7% A；10～20 min，7%～20% A；20～40 min，20%～40% A；40～60 min，40%～65%A；60～70 min，65%～90% A；70～75 min，90%～7% A），流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃。以70%甲醇作为空白溶剂，吸取样品溶液10 μL，于280 nm 波长处测定，即得HPLC指纹图谱。

1.3.5 近红外一致性评价模型建立 取全部20 批牡丹皮样品，每一批分别对其0、5、10、20 和30 kGy 吸收剂量的样品使用光纤漫反射探头进行图谱采集：分辨率8 cm-1，光谱扫描范围12 000～4 000 cm-1，每个样品重复扫描3 次，同时采集背景光谱并在每个检测光谱中予以扣除，求取平均光谱。将未辐照（0 kGy）样品的图谱设置为参考光谱，将辐照后样品的图谱设置为测试光谱，对预处理方法、平滑点数等参数进行优化，创建一致性评价模型。

1.3.6 抑菌活性评价模型建立

1.3.6.1 牡丹皮水提物制备 取1.3.4 中的3 批样品，每一批分别取0、5、10、20 和30 kGy 吸收剂量的辐照样品制备水提物。称取50 g 至三角瓶中，加500 mL纯化水，精密称定质量，浸泡30 min 后煎煮，煮沸后用文火再煮40 min，放冷，称定质量，加水补足减失的质量，取全部煎煮液，3 000 r·min-1离心5 min，收集全部上清液，旋转浓缩至1 g·mL-1，即得。取金黄色葡萄球菌标准菌株适量，接种至100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，于33 ℃培养24 h，备用（浓度约为107CFU·mL-1）。

1.3.6.2 牡丹皮水提物对金黄色葡萄球菌活性的量效关系考察 取直径为90 mm 的平皿，注入已融化的抗生素检定用培养基Ⅰ 20 mL，使之在皿底均匀摊布平整，待凝固后作为底层；另取培养基适量，加热融化后放冷至50 ℃，加入适量金黄色葡萄球菌菌液，使菌液浓度约为105CFU·mL-1，摇匀后分别向每一平皿注入5 mL，使之在底层培养基上均匀摊布平整，放置水平台面冷却后使用。取牡丹皮未辐照（0 kGy）样品的水提物，用无菌水梯度稀释成各种浓度的溶液，各浓度之间剂距为0.8，抑菌圈直径测定采用管碟法，取备妥的双碟若干，每只碟内以等距离均匀放置6 个牛津杯，分别依次加入各种浓度的提取液，用无菌陶瓦盖覆盖后，置36 ℃培养16 h。取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，预试验完成后，选取适宜的系列浓度重复3 次试验，取抑菌圈直径平均值，以浓度剂量为横坐标、抑菌圈直径大小为纵坐标拟合回归方程。找到水提物剂量和抑菌圈直径呈线性关系的剂量范围。

1.3.6.3 牡丹皮抑菌活性测定 根据量效关系曲线，选取适宜的浓度测定牡丹皮抑菌活性。测定每1 批样品时，取双碟6只，各碟内间隔的3只牛津杯滴满某一浓度的水提物（1只为未辐照对照，另2只为某一剂量辐照样品），另3 只牛津杯按以上设置滴满另一浓度的水提物，按照1.3.6.2量效关系考察方法进行培养和测定。

1.4 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 60Co-γ辐照灭菌对牡丹皮微生物负载的影响

由于《中华人民共和国药典 2020 年版 四部》未规定使用前需煎煮的中药材或饮片的微生物限度，故参照《美国药典》USP-NF2023“非无菌营养和膳食补充剂的微生物限度标准”中“使用前用沸水处理的植物”标准进行评价。即1 g牡丹皮药材中需氧菌总数应≤106，霉菌和酵母菌总数应≤104，耐胆盐革兰阴性菌应≤102。由表1 可知，3 批样品未辐照（0 kGy）前需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数以及耐胆盐革兰阴性菌指标均超过限量值。经5 kGy 吸收剂量处理后，各批次1 g 样品中需氧菌总数下降至360～540 CFU·g-1，霉菌和酵母菌总数下降至120 CFU·g-1及以下，耐胆盐革兰阴性菌数量也降至10 CFU·g-1以下。上述结果说明5 kGy60Co-γ 辐照吸收剂量能够较好地杀灭试验样品中的微生物。

表1 不同吸收剂量60Co-γ射线辐照对牡丹皮微生物存活数的影响Table 1 Effects of different dose of 60Co-γ irradiation on the microorganism of Cortex Moutan/（CFU·g-1）

2.2 60Co-γ辐照灭菌对牡丹皮指纹图谱的影响

分别将3 批样品0、5、10、20 和30 kGy 吸收剂量辐照后测得的HPLC 图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析软件（2012.130723 版本）。选择工作状态为生成对照，将未辐照样品（0 kGy）设置为参照图谱，采用多点校正的方式对各图谱共有峰进行峰匹配，共匹配到56个共有峰（图1）。相似度计算结果表明，吸收剂量为5 kGy 时，相似度下降至0.905～0.944；剂量为30 kGy时，相似度下降至0.864～0.916（表2），说明在设定剂量范围内辐照后，牡丹皮指纹图谱发生了变化。

图1 不同剂量60Co-γ辐照处理后牡丹皮指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint chromatograms of Cortex Moutan irradiated by different dose of 60Co-γ

表2 不同吸收剂量60Co-γ辐照灭菌后牡丹皮HPLC指纹图谱相似度Table 2 HPLC fingerprint chromatograms similarity evaluation of Cortex Moutan irradiated by different dose of 60Co-γ

2.3 牡丹皮60Co-γ辐照灭菌近红外一致性评价

由图2 可知，20 批牡丹皮样品共得到100 张原始光谱，辐照与未辐照样品难以进行区分。采用OPTUS 5.0 图谱处理软件，以20 张未辐照（0 kGy）样品的光谱作为参考光谱并进行平均光谱处理，以平均光谱作为建立一致性模型的基础。以80 张辐照（5～30 kGy）样品的光谱作为测试光谱进行验证。模型的预处理采用二阶导数，平滑点为9。对建立的模型进行验证，结果表明，所建立的一致性评价模型能有效识别出未辐照的牡丹皮样品和辐照后的牡丹皮样品，一致性指标（consistency index，CI）值为3.6，且区分度较大（图3），说明可以通过建立近红外一致性评价模型对辐照后的牡丹皮进行辨别。

图2 牡丹皮样品近红外光谱图Fig.2 Near infrared spectrogram of Cortex Moutan samples

图3 牡丹皮样品近红外一致性评价模型Fig.3 Near-infrared consistency evaluation model of Cortex Moutan samples

2.4 60Co-γ辐照灭菌对牡丹皮抑菌活性的影响

对牡丹皮未辐照样品不同浓度水提物抑菌圈直径进行测量（图4-A），以浓度（C）为横坐标，抑菌圈直径大小（D）为纵坐标，进行线性拟合。得到量效关系直线方程式：

图4 牡丹皮水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性Fig.4 The water extract showed inhibitory activity against Staphylococcus aureus of Cortex Moutan

拟合系数R²=0.985 6，表明当牡丹皮水提取物浓度为0.13～0.41 g·mL-1时，提取物浓度与抑菌圈大小线性关系良好。

根据量效关系试验结果，在建立的标准曲线范围内，选择0.13 和0.41 g·mL-1两个浓度，采用管碟法进行抑菌活性测试（图4-B）。对于同一批样品，分别比较在同一浓度下各吸收剂量之间抑菌圈直径差异（采用配对样本t检验进行统计分析）。测量结果如表3所示，同一批样品不同辐照剂量下的抑菌圈直径均无显著差异（P＞0.05）。上述结果表明，辐照未显著影响牡丹皮水提物对金黄色葡萄球菌的活性。

表3 牡丹皮水提物对金黄色葡萄球菌活性抑菌圈直径测量结果Table 3 Measurement results of the diameter of the zone of inhibition of the Staphylococcus aureus/mm

3 讨论

3.1 牡丹皮60Co-γ辐照灭菌剂量应控制在5 kGy以下

吸收剂量与灭菌效果的量效关系已有较多报道［23］。如尚炳娴等［24］研究了开心散最佳60Co-γ 射线辐照工艺，当吸收剂量达到6 kGy 及以上时能完全杀灭制剂中的微生物。周诗施等［25］研究发现，60Co-γ 吸收剂量达4 kGy 时，已能完全杀灭红花生粉中的微生物。为考察不同吸收剂量60Co-γ辐照对牡丹皮的灭菌效果，本研究选取具有代表性的高负载微生物样品进行测试，当吸收剂量为5 kGy 时，卫生学指标均达到《美国药典》USP-NF2023［21］中“使用前用沸水处理的植物”的控制标准；当吸收剂量达到10 kGy 时，未检出需氧菌、霉菌和酵母菌及耐胆盐革兰阴性菌。因此，在对牡丹皮进行灭菌时，建议将60Co-γ 吸收剂量控制在5 kGy以下。

3.2 60Co-γ辐照对牡丹皮化学成分有一定影响

中药指纹图谱是指中药经适当方法处理后，应用一定手段获得的能够标示该药材特征的共有峰图谱［26］。中药指纹图谱能够反映一些化学成分的种类和数量，在一定程度上可表征中药质量。本研究HPLC指纹图谱分析表明，随着吸收剂量的增加，指纹图谱相似度呈下降趋势，说明即使在国家允许的60Co-γ 吸收剂量下也会引起牡丹皮样品某些化学成分的改变。关于辐照引起中药材及制剂HPLC 指纹图谱发生变化的结果已有较多报道，如张梦晨等［27］研究发现，当吸收剂量达到8 kGy 时，山药指纹图谱中一些共有峰的相对保留时间与未辐照样品相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；蒋桃［28］研究了辐照对六味安消散的影响，结果表明，经10 kGy 辐照后，样品HPLC 指纹图谱与未辐照的相似度降低至0.827。本研究结果表明，当辐照吸收剂量为5 kGy 时，既可以达到较好的杀菌效果，又不会引起牡丹皮指纹图谱发生较大改变，可为牡丹皮加工过程中辐照灭菌的剂量设置提供参考。

3.3 近红外一致性评价模型可区分辐照与未辐照牡丹皮

近红外一致性评价模型常被用于药品质量控制和真伪鉴别等［29-31］。其基本原理是测定一组参考光谱，计算参考光谱在各个波长的吸光度和标准偏差，将各个波长的平均值加减若干倍的标准偏差作为该波长的可信区间［32］。待测光谱在该波长下，吸光度与平均值的差值除以标准偏差为一致性指数，即预设置的倍数值CI，一致性评价时将待测光谱的CI值与之前设置的CI 值进行比较，可快速判断测试光谱与参考光谱的一致性［33］。本研究建立的牡丹皮一致性评价模型，采用二阶导数进行预处理，并设置适宜的平滑点数以消除背景干扰，能有效区分辐照与未辐照样品，未辐照的样品CI 值小于3.6，而辐照（＞5 kGy）后的样品CI 值大于3.6。说明辐照与未辐照牡丹皮样品在近红外光谱上存在差异，推测辐照引起牡丹皮中含氢基团变化，从而导致特征信息改变。

3.4 60Co-γ辐照灭菌对牡丹皮抑菌活性无显著影响

据报道，牡丹皮的水提物具有一定的抑菌作用，例如宫毓静等［34］考察了10种中药材水提物对白色念珠菌浮游菌最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和抑制50%生物膜的作用，发现仅牡丹皮和高良姜对白色念珠菌的生物膜有抑制作用。胡永志等［35］将牡丹皮提取物丹皮酚添加到漱口水配方中，发现其对牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌有一定的抑制作用。傅若秋等［36］研究发现，牡丹皮水提物和醇提物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌均有较好的抑制作用。在前期药敏试验时，本研究也发现金黄色葡萄球菌对牡丹皮水提物最敏感，故选为试验菌株。参照《中华人民共和国药典 2020 年版 四部》［22］“中药生物活性测定指导原则”，本研究设置剂量梯度试验，找到了水提物与抑菌活性呈线性关系的浓度范围，并选取适宜浓度对辐照前后的抑菌活性进行了对比。测定结果表明，经5～30 kGy 吸收剂量辐照后，牡丹皮水提物对金黄色葡萄球菌活性未发生明显变化，推测辐照虽然改变了一些化学成分，但未对相关的抑菌成分物质产生影响。

4 结论

本研究基于化学指纹图纹-近红外光谱-抑菌活性分析了60Co-γ 辐照灭菌对牡丹皮质量的影响。结果表明，辐照会引起指纹图谱相似度发生变化，且与辐照剂量存在一定相关性；通过近红外光谱一致性评价模型能较好地区分辐照与未辐照样品，说明辐照引起牡丹皮含氢基团发生改变；辐照后牡丹皮水提物的抑菌活性未出现显著变化，推测与抑菌活性相关的成分未受到辐照影响。综上，建议相关企业对牡丹进行60Co-γ 辐照灭菌时将吸收剂量控制在5 kGy 以下。由于辐照应用于中药灭菌的时间较短，作用机理等基础研究薄弱，本研究仅对上述项目作了考察，今后还应收集不同产地样品，考察60Co-γ 低剂量辐照（＜5 kGy）对灭菌效果、指纹图谱的影响；进一步在药效成分、稳定性影响方面展开研究。