林炎娟 叶新福 方智振 周丹蓉
(福建省农业科学院果树研究所,福建 福州 350013)
李(PrunussalicinaLindl.)属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物,栽培历史悠久,果实营养丰富、酸甜可口,深受消费者青睐[1]。但是,李是温带落叶果树,在休眠期需要一定的低温才能解除休眠,缺乏冬季低温会导致开花延迟或不正常开花,并对果实品质和产量产生负面影响,在全球气候变暖的背景下,培育低需冷量李品种尤为迫切[2-3]。
福红李是三月李经60Co-γ 射线辐照(辐射剂量为50 Gy)诱变选育出的李新品种[4],多年观察发现,该品种具有低需冷量、早熟和红皮红肉等优点,适宜南方种植,可为南方地区因低温不足制约李生产提供替代品种。目前,该品种在福建、贵州、广西、海南和宁夏等李主要产区均有种植,亩产量最高可超过2 000 kg,具有很好的市场前景。鉴于果实品质是决定市场接受度和商品价值的重要因素,明确该品种的品质特征,可助力品种示范与推广。而糖类、有机酸、氨基酸和挥发性成分等物质组成和含量是评价果实品质的重要指标,对风味和口感有重要影响[5]。
已有研究表明,不同品种李果实品质成分和含量有所差异。例如,刘硕等[6]分析了多个李品种糖酸组分,发现欧洲李果实糖酸组成以葡萄糖、山梨醇、奎宁酸和苹果酸为主,而中国李糖酸组分以蔗糖和苹果酸为主,由此二者形成不同风味。Singh 等[7]研究发现,Amber Jewel 果实中糖组分以果糖为主,其次是葡萄糖、山梨醇和蔗糖等。陈守一等[8]研究认为,16份晚熟李的果实营养成分具有一定差异和自身特性。祝建等[9]对湖北省栽培的30 个李品种的品质进行分析发现,其展现出丰富的多样性。王珊珊等[10]分析了东北地区10 份李种质资源果实香气成分,发现不同品种之间既有共有香气成分,又有特异香气成分。此外,不同成熟度果实品质有所不同。Yu等[11]研究发现,皇冠李果实中葡萄糖含量随成熟度增加显著积累。薛晓敏等[12]研究发现,金艳和金丰李果实中蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇含量和金丰总酸含量随着成熟度增加均呈上升趋势,而金艳总酸含量随着成熟度增加呈先增后降趋势。但关于福红李的研究目前主要集中在基因鉴定方面[13-14],对其不同成熟阶段较为全面的品质特征尚不清楚。因此,本研究对三个成熟阶段果实的营养品质指标及香气组分进行检测分析,旨在完善福红李的品质特征研究,同时为李优质育种提供参考。
福红李采自福建省福州市永泰县盖洋乡前湖村仙亭山李果园(118°29′E,25°50′N,海拔650 m),根据不同发育期将果实分为花后130 d(130 days after flowering,130DAF)、花后140 d(140 days after flowering,140DAF)和花后150 d(150 days after flowering,150DAF),分别代表七成熟、八成熟和九成熟三个成熟阶段。
甲醇、乙腈(色谱级),上海安谱实验科技股份有限公司;磷酸(色谱级),上海麦克林生化科技有限公司;磷酸氢二钾(分析纯)、蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、酒石酸、琥珀酸、丙酮酸、柠檬酸、奎宁酸、苹果酸(标准品,色谱级),上海源叶生物科技有限公司;乙酸(色谱级),阿拉丁试剂(上海)有限公司;氨基酸(标准品,色谱级),美国sigma试剂公司;可溶性糖含量和异柠檬酸含量测定试剂盒,苏州格锐思生物科技有限公司。
NH300 型便携式色差仪,深圳市三恩驰科技有限公司;PAL-1型数显折射仪,日本ATAGO公司;TLG-16低温离心机,湖南湘仪离心机有限公司;干式氮吹仪,无锡沃信仪器有限公司;LC-100 液相色谱仪,上海伍丰科学仪器有限公司;MD190酶标仪,美谷分子仪器(上海)有限公司;FlavourSpec®风味分析仪,德国G.A.S.公司。
1.3.1 色差值测定 色差值测定采用NH300型便携式色差仪,以白板为对照,测定不同成熟阶段李果实果皮和果肉的亮度(L*)、红绿度(a*)、黄蓝度(b*)、彩度值(C*)和色调角(h*),果皮测定部位为果实赤道中心,果肉测定部位为果实赤道切去小圆片的圆心处,每个处理10 个果实,3个重复。
1.3.2 可溶性固形物、可溶性糖、异柠檬酸含量和糖酸比测定 可溶性固形物含量采用PAL-1 型数显折射仪测定,其中,每两个果实混合挤汁测定一次数据,每个处理10个果实,3个重复;可溶性糖和异柠檬酸含量采用苏州格锐思生物科技有限公司试剂盒测定;糖酸比为可溶性糖与总酸含量的比值,其中,总酸含量测定参照GB 12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[15]。以上测定均为果肉样本。
1.3.3 葡萄糖、蔗糖、果糖和麦芽糖含量测定 样本提取:称取约0.20 g 果肉样本,加入1.5 mL 40%乙腈水溶液进行研磨提取,然后室温超声30 min,冷却后定容1.5 mL,12 000 r·min-1离心10 min,经0.45 μm 滤膜过滤后待测。
液相色谱条件:LC-100 液相色谱仪,Dikma Polyamino HILIC(250 mm×4.6 mm,5 μm),Shodex RI-201H 视差检测器;流动相60%乙腈水溶液;进样量10 μL,流速1 mL·min-1,柱温30 ℃,示差检测器温度40 ℃。以保留时间定性,外标法绘制标准曲线定量(表1)。
表1 糖标准曲线Table 1 Sugar standard curve
1.3.4 有机酸含量测定 样本提取:精确称取约0.20 g 果肉样本,加入1.5 mL 80%甲醇水溶液充分研磨磨碎,45 ℃超声提取30 min,12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min,取上清液,氮吹吹干,加入1 mL 流动相溶液涡旋震荡溶解,经0.45 μm滤膜过滤后待测。
液相色谱条件:LC100高效液相色谱仪,紫外检测器SPD-20A,柱温箱CTO-20AC,C18反相色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:0.1%磷酸水溶液,pH 值2.7;进样量10 μL,流速0.7 mL·min-1,柱温30 ℃,紫外波长210 nm。以保留时间定性,外标法绘制标准曲线定量(表2)。
表2 有机酸标准曲线Table 2 Organic acid standard curve
1.3.5 氨基酸含量测定 样本提取:(1)称取约0.50 g果肉样本,按0.007 5 L·g-1的比例加入6 mol·L-1盐酸溶液,研磨成匀浆;(2)用移液器吸取1 mL 匀浆液,转移至水解管中,充氮气5 min,然后密闭,放置在烘箱中,110 ℃水解18 h;(3)将水解后的样品转移至1.5 mL离心管,12 000 r·min-1离心5 min;(4)取0.5 mL 上清转移至洁净的离心管,然后放置在真空离心浓缩仪中,真空干燥直至无明显可见的液体;(5)加入0.5 mL 0.1 mol·L-1的盐酸溶液,用移液器反复吹吸,使样品充分溶解;(6)12 000 r·min-1离心5 min,将上清液转移至新的离心管中备用。
样品衍生:(1)取200 μL 样品加入20 μL 正亮氨酸,混匀;(2)加入100 μL 三乙胺溶液,100 μL 异硫氰酸苯酯溶液,混匀后室温放置1 h;(3)加入400 μL 正己烷,剧烈振荡15 s,然后12 000 r·min-1离心2 min;(4)取下层液上机进行高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC)分析。标准品衍生方法同样品衍生。
液相色谱条件:LC-100 高效液相色谱仪、氨基酸专业柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A:0.05 mol·L-1乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH 值为6.50);流动相B:甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20(V∶V∶V) (流动相梯度见表3);进样量10 μL,流速1.0 mL·min-1,柱温35 ℃,紫外波长254 nm。以保留时间定性,外标法绘制标准曲线定量(表4)。
表3 流动相梯度Table 3 Mobile phase gradient/%
表4 氨基酸标准曲线Table 4 Amino acid standard curve
1.3.6 挥发性成分测定方法 本次气相色谱离子迁移谱联用仪(gas chromatography ion migration spectrometer,GC-IMS)分析委托山东海能科学仪器有限公司应用实验室完成,样品寄送采用干冰和冰袋包装后运输。
样品制备:称取3.50 g 液氮速冻的均匀大小果肉块样品,直接装入20 mL顶空瓶中。
气相-离子迁移谱分析条件:分析时间为30 min;色谱柱类型为MXT-5、15 m、0.53 mm ID、1.0 μm df;柱温为60 ℃;载气/漂移气为氮气;离子迁移谱温度为45 ℃。
自动顶空进样条件:进样体积为500 μL;孵化时间为15 min;孵化温度为40 ℃;进样针温度为85 ℃;孵化转速为500 r·min-1。
气相色谱条件:运行时间为30 min,初始2 mL·min-1,保持2 min 后8 min 内升至10 mL·min-1,10 min 内升至100 mL·min-1,10 min内升至150 mL·min-1。
数据处理:采用GC-IMS 设备自带仪器分析软件对挥发性成分进行定性定量和图谱绘制。
试验数据采用Excel 2016 软件进行数据处理、统计分析及作图,应用SPSS 24.0 软件进行显著性分析。
由图1 可知,随着成熟度的增加,李果皮和果肉红色区域逐渐增大,颜色越来越深。不同成熟阶段李果皮和果肉色差值见表5。由表5可知,不同成熟阶段李果皮和果肉亮度(L*)、红绿度(a*)、黄蓝度(b*)、彩度值(C*)和色调角(h*)变化趋势不同。随着成熟度的增加,果皮L*值呈现先上升后下降趋势,果肉L*值呈现先下降后上升趋势;果皮和果肉a*值均呈现逐渐上升趋势;果皮和果肉b*值均呈现先下降后上升趋势;果皮C*值呈现先下降后上升趋势,果肉C*值呈现上升趋势;果皮h*值呈现下降趋势,果肉h*值呈现先下降后上升趋势。
图1 不同成熟阶段福红李果实外观Fig.1 Appearance of Fuhong plum at different maturity stages
表5 不同成熟阶段福红李果皮和果肉色差值Table 5 Chromatic aberration value of peel and pulp of Fuhong plum at different maturity stages
由表6 可知,蔗糖、葡萄糖和果糖分别占可溶性糖含量的36.61%~49.28%、23.31%~26.50%和18.12%~20.42%,是福红李果肉中的主要糖类。140DAF 和150DAF阶段李果实可溶性固形物含量接近,显著高于130DAF。可溶性糖和蔗糖随成熟度增加不断积累,150DAF 阶段李果实可溶性糖和蔗糖含量均显著高于130DAF 和140DAF。葡萄糖含量随成熟度增加呈现先上升后下降趋势,140DAF阶段葡萄糖含量显著高于130DAF 和150DAF。不同成熟阶段李果实果糖含量差异不显著。相较前三个糖组分,麦芽糖在李果实中含量较低,随成熟度增加呈现先下降后上升趋势。
表6 不同成熟阶段福红李果实可溶性固形物及糖含量Table 6 Soluble solids and sugar content of Fuhong plum at different maturity stages
由表7可知,本研究从福红李果肉中鉴定出7种有机酸,包括苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、异柠檬酸、奎宁酸、丙酮酸和酒石酸。苹果酸是福红李果肉中的主要有机酸,含量远高于其他6种有机酸,占有机酸总含量高达88.76%,且随成熟度增加,呈现先上升后下降趋势,在140DAF 阶段含量最高,为17.03 mg·g-1。果实内琥珀酸、柠檬酸和丙酮酸含量较低,随成熟度增加,呈逐渐上升趋势。异柠檬酸含量随成熟度增加呈现先下降后上升趋势,奎宁酸和酒石酸含量随成熟度增加呈现先上升后下降趋势。
表7 不同成熟阶段福红李果实有机酸含量Table 7 Organic acid content of Fuhong plum at different maturity stages/(mg·g-1)
由表8可知,150DAF果实糖酸比显著高于130DAF和140DAF(P<0.05)。由此可见,150DAF 福红李果实表现出更佳的食用品质。
表8 不同成熟阶段福红李果实糖酸比Table 8 Soluble solids and sugar content of Fuhong plum at different maturity stages
由表9可知,在整个成熟期,9个非必需氨基酸和7个必需氨基酸含量范围分别为11.58~357.47、55.59~176.63 μg·g-1,其中,在必需氨基酸中,含量最高的是亮氨酸,其次是赖氨酸和苏氨酸,含量最低的是蛋氨酸。不同氨基酸含量随成熟度变化呈现不同变化趋势,组氨酸含量随成熟度增加呈现先下降后上升趋势,甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量随成熟度增加呈逐渐上升趋势,其他氨基酸含量随成熟度增加均呈现先上升后下降趋势,组间差异显著(P<0.05)。由此可见,氨基酸多数在成熟度后期140DAF和150DAF积累。
表9 不同成熟阶段福红李果实氨基酸含量Table 9 Amino acid content of Fuhong plum at different maturity stages/(μg·g-1)
2.6.1 不同成熟阶段福红李果实挥发性成分谱图对三个不同成熟阶段福红李果实挥发性成分进行分析,由仪器自带LAV 分析软件中的Reporter 插件程序获得3D 谱图(图2)。X 轴表示迁移时间,Y 轴表示保留时间,Z 轴表示峰强度,红色垂直线表示离子峰,离子峰右侧区域每一点代表一种挥发性成分,颜色深浅程度代表挥发性成分含量高低。由图2 可知,三个不同成熟阶段福红李果实挥发性成分图谱近似,但单从色彩角度观察较难直观区分挥发性成分含量差异。
图2 不同成熟阶段福红李果实挥发性成分GC-IMS三维图谱Fig.2 Three dimensional GC-IMS spectra of Fuhong plum at different maturity stages
因此,以130DAF 样本谱图为参照,绘制福红李果实GC-IMS 二维差异对比谱图(图3),可直接对不同成熟阶段福红李挥发性成分进行差异性对比分析。其中,140DAF 和150DAF 谱图中的白色代表挥发性成分含量与130DAF 相同,红色代表该样品浓度高于130DAF,而蓝色则代表低于130DAF 样品。由图3 可更加明显地看出,130DAF、140DAF 和150DAF 李果肉挥发性成分含量存在明显差异。
为了明确不同成熟阶段福红李果肉中具体哪些物质存在差异,本研究选取所有峰进行指纹图谱对比。由图4 可知,(Z)-3-己烯基乙酸、乙酸正己酯和反-2-己烯乙酸酯在140DAF、150DAF样品中的含量较高(黄色框);乙酸乙酯在150DAF 样品中的含量明显高于130DAF、140DAF样品(橙色框);苯甲醛、反-2-戊烯醛在140DAF 样品中的含量明显高于130DAF、150DAF样品(白色框);丁醛、2-丁酮、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-戊酮和2 号未知化合物在130DAF、140DAF 样品中的含量明显高于150DAF样品(红色框)。
图4 不同成熟阶段福红李果实挥发性成分指纹图谱Fig.4 Fingerprints of volatile components of Fuhong plum at different maturity stages
2.6.2 不同成熟阶段福红李果实挥发性成分定性分析 基于仪器内置的NIST谱库和自建迁移时间库,根据挥发性成分的GC 保留时间和IMS 漂移时间鉴定出李果肉中含有醛类9种、酯类3种、醇类4种、酮类3种、萜烯类5种及1种酸类等25种挥发性物质。由表10可知,李果实中峰强度最高的是醛类,其次是醇类和酯类,酮类、萜烯类和酸类物质峰强度较低。所有物质中,己醛(D)和2-己烯-1-醇(D)峰强度较高,分别具有青草香、香脂味[16]和草香、坚果味[17]。其中,大多数醛类、萜烯类和酸类在140DAF 阶段积累最多;大多数酮类和醇类在130DAF 阶段积累最多;而酯类则多数在150DAF 阶段积累。由此可见,不同成熟阶段果实挥发性成分组成和丰度具有差异,呈现出不同的香气积累特征。
表10 不同成熟阶段福红李果实中鉴定出的挥发性物质Table 10 Volatile compounds identified in Fuhong plum at different maturity stages
红色往往代表着果实成熟度高,具有较好的口感和风味。前人研究表明,花色苷是影响李果实红色色泽的重要物质[18-20],其总含量在果实成熟过程中不断积累使李果逐渐转红[21-24]。本研究也发现,随着成熟度的增加,果实外观逐渐变红,红色区域逐渐增多。色差值测量结果显示,随着成熟度的增加,代表果实红绿度的a*值逐渐上升,表明果实随成熟度增加逐渐变红。
果实的甜酸口味主要来源于糖酸的组成、含量和比例,其含量是果实营养及风味形成的重要指标。各糖组分对甜度的贡献不同,蔗糖为1,果糖约为1.75,葡萄糖约为0.75[6]。本研究发现,福红李果实中含量最高的糖组分为蔗糖,且随成熟度增加而显著递增,150DAF 时的含量可高达44.59 mg·g-1,占可溶性糖含量的49.28%。其中,在140DAF 和150DAF,蔗糖、葡萄糖和果糖含量比例接近2∶1∶1,与刘硕等[6]报道的中国李可溶性糖构成相似,可呈现较好的甜度。前人对不同李品种果实中糖组分的研究已有较多报道,不同李品种果实糖组成有所不同。其中,姜翠翠等[25]和阳爱民等[26]发现,芙蓉李、秋姬李、红李、黑宝石李、苹果李和蜂糖李等果实中葡萄糖含量最高,胭脂李、华蜜大蜜李、红线李和黑琥珀李等果实中果糖含量最高,珍珠李和凌云牛心李等果实中蔗糖含量最高。而在成熟过程中,蔗糖含量出现递增可能是糖合成相关酶活性增强作用的结果[27-28]。本研究中蔗糖含量变化与薛晓敏等[29]研究金艳和金丰李果实结果相似,与赵树堂等[30]在4个李品种果实上糖含量变化结果相同。
有机酸组分与含量差异除与糖共同决定果实甜酸风味外,也贡献果实独特风味。本研究发现,福红李果实主要酸组分是苹果酸,占有机酸总量的81.63%~88.76%,属苹果酸型,且随成熟度增加呈现先上升后下降趋势。刘硕等[6]研究发现,除欧洲李果实以奎宁酸和苹果酸为主外,其他李品种果实均以苹果酸为主,占有机酸总量的63.24%~96.05%。果实中苹果酸酸味爽口、呈味速度慢、酸感维持时间长,其含量变化由NAD-苹果酸脱氢酶、NADP-苹果酸酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和柠檬酸合酶等多种代谢酶共同调控,且受遗传特性与自然环境的影响[31]。王小红等[32]研究发现,蜂糖李和四月李苹果酸含量在果实发育期也呈现先上升后下降的趋势,该研究认为苹果酸含量的大量积累受磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和NAD-苹果酸脱氢酶活性共同调控,但不同品种苹果酸合成与降解的关键酶不同。薛晓敏等[29]研究金艳李果实上苹果酸含量变化,也有相同结论。Usenik 等[33]研究发现,李果实苹果酸含量随成熟度上升逐渐下降,与本研究有所差异,出现不同结果的原因可能与品种、栽培环境等有关。与三月李相比,福红李有更高的可溶性固形物、总糖、可溶性糖、蔗糖、还原糖含量和较低的可滴定酸含量,以及较高的糖酸比,展现出更优的食用品质[34]。福红李果实可溶性固形物含量和糖酸比在130DAF 较低,至150DAF 显著提高,糖酸比高达12.44,这说明后者食用品质明显提升,呈现出较佳酸甜口感。
氨基酸的含量和种类是评价果实营养价值及口感风味的重要指标[35]。从福红李中测出16种氨基酸,这些氨基酸含量在福红李成熟期内变化差异明显,呈现上升、上升-下降和下降-上升等3种变化规律。其中,非必需氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸含量较高,可贡献果实鲜味,必需氨基酸中亮氨酸含量较高。崇慧影等[36]研究发现,九阡李以天冬氨酸和谷氨酸含量较高;周丹蓉等[37]研究发现,多个李品种果实含量最高的氨基酸均为天冬氨酸和谷氨酸;陈守一等[38]研究发现,贵州晚熟李果实平均值最高的氨基酸为天冬氨酸,与本研究结果相似。
果实香气取决于挥发性成分等嗅感物质的组成和丰度。本研究发现,福红李主要香气成分是醛类、醇类、酯类,其次为萜烯类、酸类和酮类。柴倩倩等[39]研究发现,作为中国李、樱桃李及其杂种的代表品种绥李3 号、红果樱桃李和蜜思李的香气物质分别是醛类、醇类和酯类。王珊珊等[10]研究发现,不同品种李果实香气的主要种类为醛类和酯类。上述研究均与本研究结果相似,但具体特征香气成分不同。另外,香气的呈味不仅与挥发性成分含量相关,与风味阈值也有关,研究其风味阈值对香气的贡献率,才能进一步明确有效香气成分[40]。本研究发现,福红李不同成熟阶段香气成分的含量有差异,醛类物质多数在果实140DAF阶段积累,醇类物质多数在果实130DAF 阶段积累,酯类物质多数在150DAF阶段积累,表明不同成熟阶段李果实具有不同香气特征。王华瑞等[41]也有类似研究结论,即不同发育时期黑宝石李果实香气成分的组成及含量差异较大。但具体成分变化机制还有待进一步研究。
本研究基于HPLC 和GC-IMS 技术分析果实糖、有机酸、氨基酸和挥发性成分等指标,明确了果实主要营养品质成分为蔗糖、苹果酸、谷氨酸、亮氨酸等物质,主要香气成分为己醛、2-己烯-1-醇等醛类与醇类。同时,初步探讨了上述成分在成熟过程中的变化规律,结果显示不同成分呈现出不同成熟积累特征,其中,可溶性糖和蔗糖在花后150 d积累更多,苹果酸、谷氨酸、亮氨酸和己醛等在花后140 d 积累更多,而己醛和2-己烯-1-醇分别在花后140 d 和花后130 d 积累更多。综上所述,福红李在花后150 d 时的营养品质最佳,而不同成熟阶段果实香气特征不同。