磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响

黎颖惠 邢肖毅 仇旭 许仕荣 倪绯 赵炼 杨贤均

关键词：磷肥；磷活化；稻田土壤；有效磷；磷酸酶；phoD；解磷菌

磷素是植物生长必需的大量元素之一，我国农田土壤普遍缺磷。一般认为，有效磷含量低于10mg/kg的土壤即为缺磷土壤。而我国湖南、江西、广西、云南等典型红壤区，土壤有效磷含量多在5mg/kg左右，远低于世界平均水平。施用磷肥是提高土壤有效磷含量的重要途径，红壤区磷肥投入水平往往较高。然而，红壤富含铁铝矿物，对磷素具有极强的结合固定能力，研究显示约有80%的磷肥进入红壤后，通过吸附、共沉淀等过程被土壤颗粒快速固定，成为难以被作物吸收利用的固定形态，导致土壤中固定态磷大量蓄积。因此，红壤中存在着有效磷不足与固定态磷盈余的双重问题。活化土壤磷库，开发和有效利用被土壤固定的磷，提高土壤磷素利用效率，是解决上述矛盾的关键。有研究表明，适量施用磷肥不仅可以补充外源速效磷，还可降低土壤对磷酸根的吸附量，甚至促进土壤本底磷的矿化，提高土壤供磷能力。Bauke等对磷肥施用条件下土壤本底磷释放能力的研究结果表明，相较于不施磷肥，适量施用磷肥更有利于底层土壤固定态磷的释放。

土壤中分布着大量的解磷菌，是土壤磷活化的主要驱动者，可通过分泌磷酸酶促进有机磷的活化。解磷菌在自然状态下，多处于休眠或潜在活跃状态，解磷效率较低。适当施用磷肥可刺激解磷菌的生长，激发土壤本底无效磷的释放。李春越等基于分离培养法研究发现，适当施用磷肥[60kg/（hm2·a）]可提高黄土区农田土壤有机磷和无机磷细菌丰度，且有机磷细菌对磷肥更为敏感，最终促进有机磷矿化。微生物对有机磷的活化主要指磷酸酶的矿化作用，其中碱性磷酸酶几乎特异性地来源于微生物，因此被認为是有机磷微生物活化过程的重要驱动者。碱性磷酸酶的编码基因phoD由于分布广泛，活性强、多样性高，被广泛应用于土壤有机磷转化过程的研究。已有研究表明，当土壤适量施用化学磷肥时，可提高含phoD基因的解磷菌丰度及某些特定类群的相对丰度，继而增加磷酸酶活性，提高土壤有效磷含量。例如，当土壤中施人50mg/kg的磷素时，相较于不施磷肥和200mg/kg的施磷处理，其phoD基因丰度最高，且不同用量磷肥施用条件下，解磷菌的组成不同。然而，当化学磷肥施用量较大时，会抑制解磷菌的生长和磷酸酶的合成。尽管目前关于磷活化的研究已经较多，但是对于红壤区磷肥施用量对土壤磷活化及解磷菌群落结构影响的研究还比较少见，解磷菌在磷活化中的作用尚不明确。为此，本研究以红壤区稻田土壤为材料，对比分析磷肥不同施用量处理下，土壤有效磷含量、磷酸酶活性的变化，以及含phoD基因解磷菌的群落特征，明确磷肥施用对土壤磷活化的影响及其微生物驱动机制，以期为红壤区磷肥高效利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试土壤和培养方法

2020年10月在湖南省邵阳市红壤区采集稻田0～20cm土层土壤，土壤有效磷含量为11.39mg/kg。土样风干过2 mm筛后，调节土壤水分为25%孔隙充水度（25% WFPS），25℃培养一周以恢复微生物活性。以磷酸二氢钾形式施入磷肥，磷素设置20（P20）、50（P50）、80 mg/kg（P80）3个水平，调节土壤水分为60%田间持水量，每个处理称取50g土壤，于100mL玻璃培养钵中进行好氧培养，每处理重复3次，在25℃下培养一周。

1.2样品采集、测定项目及方法

培养结束后，充分混匀培养钵中的土壤样品，取约10g样品置于-80℃条件下保存，用于测定含phoD基因解磷菌群落结构，其余样品于4℃保存，用于测定土壤有效磷含量和磷酸酶活性。

土壤总DNA的提取采用mobio试剂盒，含phoD基因解磷菌的扩增引物为ALPS-730F（CAGTGGGACGACCACGAGGT）和ALPS-110IR（GAGGCCGATCGGCATGTCG）。扩增条件为95℃5min;95℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环：72℃10min。高通量测序平台为Illumi-na，由上海美吉生物医药科技有限公司完成，测序数据按97%序列相似度划分OTU。土壤有效磷含量采用钼蓝比色法测定，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法，酸性、中性、碱性磷酸酶的缓冲液分别为醋酸、柠檬酸和硼酸缓冲液。

1.3数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2017整理数据，用SPSS19.0软件进行统计分析。a多样性指数中，Ace和Chaol指数用来估计样本中OTU数目，Simp-son和Shannon指数用来估计样本中微生物的多样性。土壤有效磷含量、磷酸酶活性以及含phoD解磷菌a多样性的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法进行差异显著性检验（P<0.05）。采用主成分分析法（PCA）分析土壤解磷菌群落结构，数据可视化采用Canoco4.5软件进行。将OTU代表序列运用BLAST进行序列对比（ https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/），明确分类信息。

2结果与分析

2.1不同磷肥用量对稻田土壤有效磷含量的影响

磷肥施用量显著影响土壤有效磷含量（图1）。供试土壤原始有效磷含量为11.39mg/kg，施加20、50、80mg/kg磷素后，土壤有效磷含量分别升至15.92、24.04、37.08mg/kg，仅分别增加4.53．12.65、25.69mg/kg。可见施入土壤中的磷肥被大量固定，只有小部分转化为有效磷。三种施肥量条件下，土壤磷有效性指数（土壤有效磷增加量占施磷量的百分比）分别为22.65%、25.30%和32.11%，表明随着磷肥施用量的增加，有更高比例的磷素转化为土壤有效磷。

2.2不同磷肥用量对稻田土壤磷酸酶活性的影响

由图2可见，整体而言，土壤酸性磷酸酶活性高于中性磷酸酶，碱性磷酸酶活性最低，表明土壤酸性磷酸酶对磷肥的响应更为强烈。随磷肥施用量的增加，土壤酸性磷酸酶活性呈先增加后降低趋势，P50处理条件下活性最高，达4.06mg·g-1．d-1，显著高于P20和P80处理，而后二者间无显著差异。中性磷酸酶和碱性磷酸酶活性也表现为P50处理最高，但3个施肥处理间差异较小，均未达显著水平。

2.3不同磷肥用量对稻田土壤解磷茵a多样性的影响

土壤中含phoD基因解磷菌的Ace、Chaol和Shannon指数均随磷肥施用量的增加而显著降低，而Simpson则呈现相反趋势（表1）。与P20处理相比，P50、P80处理下解磷菌Ace、Chaol指数和Shannon指数分别降低14.9%、30.3%、15.0%、27.7%和13.1%、25.0%。Simpson指数则以P20处理最低，与P50和P80处理差异达显著水平，但后两者无显著差异。综上可知，施用磷肥导致土壤解磷菌的丰富度和多样性显著降低，且施肥量越大，降幅越大。

2.4不同磷肥用量对稻田土壤解磷茵群落组成的影响

对含phoD基因解磷菌的群落结构进行PCoA分析（图3），前两轴对总变异的累积贡献率为78.2%。相同磷用量处理的土壤样品在PCoA图上相对聚集，而不同用量处理的样品则明显分开，表明施用磷肥强烈影响含phoD解磷菌的群落结构。

对相对丰度大于5%的OTU绘制解磷菌群落组成图（图4），可以看出三种施肥量条件下土壤解磷菌组成差异明显。总体而言，OTU769相对丰度最大．P50处理下达到近30%，其次分别是P80和P20处理，相对丰度分别为20.09%和9.76%。将其代表序列在NCBI数据库进行BLAST比对，未比对上已有序列。OTU1036同样具有较高的丰度，尤其是P80处理相对丰度为24.93%，而P20和P50处理相对丰度均在10%左右。另外OTU975也对施肥表现出明显响应，且其相对丰度同样以P80处理最高，为11.74%，而其他两个处理下相对丰度均在5%左右。根据序列比对，OTU1036和OTU975可能从属于假单胞杆菌属（Pseudomonas）。

3讨论

本试验结果表明，施用外源磷肥显著提高土壤有效磷含量，且随磷肥用量的增加，土壤有效磷含量升高，但土壤有效磷的增加量远低于外源补充的磷量。由此可见，大量的外源磷肥被土壤颗粒所固定。这是因为红壤富含铁铝矿物，对磷素具有极强的结合固定能力。本研究中，当磷素施用量为20mg/kg时，土壤有效磷仅增加4.53mg/kg，约为施用量的22%。而当施磷量增加至50、80mg/kg时，土壤有效磷增加量占施用量的比重有所提高，分别为25.30%、32.11%。即随磷肥施用量的增加，有更高比例的磷素转化为有效磷。向晓玲等研究也发现，易解吸磷随施磷量的增加而增加。另外，较高的磷肥用量也可能促进了土壤磷的活化。马殿叶研究发现，磷素活化系数随磷肥施用量的增加而升高。

解磷微生物分泌磷酸酶对有机磷进行矿化是磷活化的重要途径之一。本研究发现，土壤酸性、中性、碱性磷酸酶活性均表现为P50处理最高，其次为P20和P80处理，并且以酸性磷酸酶最为敏感。已有研究证明酸性磷酸酶在红壤中具有较高的活性。另外，酸性磷酸酶活性易受土壤有效磷含量的影响。当土壤本底磷含量较低时，适当的磷素投入会刺激磷酸酶的表达以满足微生物的需求，而过高的投入由于缓解了微生物的磷饥饿，磷酸酶的分泌减少。马殿叶研究表明，当磷肥施用量为50kg/hm2时，磷酸酶活性高于0、25、100、200kg/hm2和400kg/hm2处理。磷酸酶活性的增加可能会导致有机磷的矿化，从而提高土壤有效磷含量，有研究表明土壤磷酸酶活性与有效磷含量呈显著正相关。然而，本研究中，磷酸酶活性以P50处理最高，而磷的有效性指数以P80处理最高，磷酸酶活性与有效磷的增量并未表现出显著的相关性，由此可见，磷酸酶活性的改变并不是磷有效性指数变化的主要因素。施用磷肥之所以提高土壤磷有效性指数，可能是因为较高磷肥用量降低了土壤的磷素吸附能力。有研究发现，随磷肥施用量的增加，土壤中高能吸附点位逐渐饱和，磷的吸附转为低能吸附，因而土壤吸附量降低，而解吸量增加。另外，本研究施用的磷肥为磷酸二氢钾，可导致土壤pH值的降低，从而促进无机磷的溶解，最终影响土壤有效磷含量。综上所述，本研究发现，施用适量磷素（50mg/kg）增加了土壤磷酸酶活性，可能促成了该处理下土壤磷有效性指数的增加，而高磷施用量处理下（80mg/kg），除外源施用的磷素外，磷吸附量的降低和无机磷溶解量的增加也可能促进了有效磷含量的增加。

磷肥不同施用量处理下，磷酸酶活性的改变依赖于土壤解磷微生物对施肥的响应。就多样性而言，随着磷肥施用量的增加，含phoD基因解磷菌的Ace、Chaol和Shannon指数显著降低，而Simpson则有所增加，表明磷肥施用导致土壤解磷菌的物种丰富度和多样性降低。施肥对土壤微生物多样性的影响已有很多研究。一般认为，适量施肥，尤其是无机肥和有机肥配合施用，可为土壤微生物提供较多的能源和较全面的养分，促进多种类群微生物的大量繁殖，从而提高土壤微生物的多样性。而施肥不均衡则可能对微生物群落的多样性产生负效应。本研究仅施用了磷酸二氢钾，未提供碳氮元素，无法为微生物提供均衡的营养和能源，可能会导致对磷钾素竞争力高的微生物类群大量繁殖，争夺大量的能源和营养，而其他微生物相对减少，从而降低物种丰富度和多样性。本研究中P50和P80处理下，OTU1036和OTU975的相对丰度显著增加，根据序列比对，二者可能从属于假单胞杆菌。而以往的研究发现假单胞杆菌对磷素具有较强的竞争力。一般认为，微生物多样性的降低会严重损伤生态系统功能。本研究中，当磷素施用量为50、80mg/kg时，有效磷的相对增量更大。這可能是因为当多样性降低导致生态系统功能受损时，微生物通过增加数量、改变组成或互作关系等进行功能补偿。

磷肥不同施用量处理下，土壤解磷菌群落结构差异显著。P50处理下，OTU769的相对丰度大幅增加，达到近30%，此时磷酸酶活性也最大，因此推测该类群可能是分泌磷酸酶的主要类群，但是并未在NCBI数据库中比对到相似序列。P80处理下，OTU1306和OTU975相对丰度显著增加，达36.7%，根据序列比对，二者可能从属于假单胞菌。假单胞菌是红壤中常见的一种强解磷细菌，且对磷肥施用敏感，其解磷机制主要是通过分泌有机酸溶解固定态无机磷。由此推测，施用磷肥可能促进了土壤中磷的活化，但不同用量处理下，解磷菌释放有效磷的方式可能不同，磷素用量为50mg/kg时，解磷菌主要分泌磷酸酶矿化有机磷，而磷素用量为80mg/kg时，解磷菌可能更多地通过分泌有机酸实现对无机磷的溶解。李春越等的研究也证明，无机解磷菌更偏好高磷环境，而有机解磷菌更偏好相对较低的磷素环境。

本研究采用差减法计算磷肥施用条件下有效磷活化量，具有一定的不准确性，未来将采用同位素标记准确定量磷活化量。另外，本试验仅研究了磷肥施用条件下解磷菌和磷酸酶活性的变化，尚不足以阐明磷活化机制，未来的研究中将进一步关注有机酸组分及其含量的变化，溶无机磷和解有机磷微生物的分布特征，并从mRNA的角度探索解磷菌的变化特征，以全面分析磷肥施用对土壤磷转化过程的影响，揭示土壤有效磷激发的机制。

4结论

磷肥施用量影响土壤供磷效率，在20～80mg/kg的磷素用量范围内，土壤磷有效性指数逐渐增加。施用磷肥降低了土壤解磷菌的多样性，同时改变了解磷菌的组成。磷肥不同用量条件下，有效磷增加的途径可能不同，50mg/kg磷素用量条件下，土壤磷酸酶活性最高，同时，含phoD基因解磷菌中OTU769（种属信息未知）相对丰度最高，推测该物种可能具有分泌磷酸酶的能力，为促进土壤本底有机磷矿化的主要物种；80mg/kg磷素处理下，土壤磷酸酶活性较低，而假单胞属的相对丰度大幅增加，推测假单胞菌可能是通过分泌有机酸溶解无机磷，从而增加有效磷含量。