FMD73D基因真核表达质粒的构建、表达及对I型IFN信号通路的作用

苗勤 吴香菊 齐静 丛晓燕 李均同 王林 杜以军

关键词：口蹄疫病毒：3D蛋白；真核表达：I型IFN信号通路

口蹄疫（foot-and -mouthdisease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease VLrLLS，FM-DV）引起的一种急性、高度接触性人畜共患传染病，主要感染牛、羊、猪等偶蹄动物，给畜牧业造成了严重的经济损失，被世界卫生组织列为A类动物疫病之首，我国也将其列为一类传染病。口蹄疫病毒属小RNA病毒科，是单股正链RNA病毒，呈二十面体对称结构。FMDV基因组全长约8500bp，仅有一个开放阅读框（open readingframe，ORF），约6.5 kb，编码一个大的多聚蛋白，在L、2A和3C的作用下裂解产生了病毒的4种结构蛋白[VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1C）和VPl（1D）]和8个非结构蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。FMDV有7种血清型，分别为A型、O型、C型、亚洲I型、SAT1型、SAT2型和SAT3型，且各血清型之间无交叉保护。

I型IFN是机体抵抗病毒天然免疫的核心，FMDV感染细胞后，病毒复制产生的RNA被宿主细胞的模式识别受体所识别，激活下游信号通路，刺激产生I型IFN和促炎细胞因子，从而启动抗病毒反应。已有研究表明，FMDV多种蛋白，如前导蛋白L、蛋白水解酶3C、非结构蛋白2B、2C等，参与调节先天性免疫信号通路，拮抗宿主天然免疫，促进病毒增殖。

FMDV 3D蛋白是病毒的RNA聚合酶，介导FMDV基因组的合成，且核苷酸和氨基酸序列高度保守。此外，3D蛋白具有T细胞表位，是一种潜在的免疫增强剂，还可以作为免疫佐剂使用。但3D蛋白在天然免疫中的作用尚不明确，本研究旨在构建FMDV 3D基因的真核表达质粒，并探索3D蛋白对I型IFN信号通路的影响，为FMD的防控提供新的靶向分子。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1细胞与质粒HEK-293T细胞、PK-15细胞、pXJ41真核表达载体、荧光素酶报告基因质粒pIFN-Luc和内参报告质粒pRL-TK均由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存。

1.1.2主要试剂PrimeSTAR⑩HS DNA Polymer-ase、DL5000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker，pMD18-T载体购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；Lipofectamine3000 Reagent、Alexa Flu-or 488-羊抗鼠IgG（H+L）购自Invitrogen公司；Western一抗稀释液购自碧云天生物技术有限公司；NC膜購自BIO-RAD公司；辣根过氧化物（HRP）标记的羊抗兔抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；Sparkjade ECL super（极超敏化学发光试剂盒）购自山东思科捷生物技术有限公司；感受态细胞DH5a、双荧光素酶报告基因试剂盒、RNA-easy Isolation Reagent试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司：限制性内切酶HindⅢ、Kpn I及T4 DNA Ligase购自Thermo FisherScientific公司；质粒小提试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒购自北京天根生物工程有限公司：DMEM细胞培养基、Opti-MEM培养基、胰蛋白酶一EDTA均购自Gibco公司：抗荧光衰减封闭剂购自Solarbio公司；鼠源、兔源Myc抗体购自Sigma -Aldrich公司；actin抗体购自上海泊湾生物科技有限公司。

1.2试验设计与方法

1.2.1FMDV 3D基因真核表达质粒的构建与鉴定

根据GenBank公布的FMDV O/BY/CHA/2010（GenBank accession no. JN998085） 3D基因序列，由北京擎科生物技术有限公司合成3D基因并连接到pMD18-T载体上。结合真核表达载体pXJ41上的酶切位点序列，加入保护性碱基及Myc标签序列，利用分子生物学软件Primer Premier5.0设计了一对扩增3D基因的特异性引物：Myc-3D-Fwd（HindⅢ）和Myc-3D-Rev，引物削匕京擎科生物技术有限公司合成，序列见表1。

以pMD18-T-3D克隆质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应体系（总体系为25uL）如下：上、下游引物（10pmol/uL）各1uL，模板（200ng/uL）0.5uL，dNTP 2uL，5xPrime STAR buffer 5uL，PrimeSTARHS DNA Polyerase（2.5 U/卜LL） 0.25uL，ddH，0补足至25uL。反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用DNA纯化回收试剂盒进行回收。

将回收纯化的3D基因和pXJ41载体用Hindm/Kpn I双酶切，酶切产物胶回收纯化后用T4DNA Ligase进行16℃过夜连接，将连接产物转化至DH5a感受态细胞，37℃过夜培养16h，挑取单菌落接种于含有氨苄西林抗性的LB培养基中，37℃、200r/min过夜培养后提取质粒，进行HindⅢlKpn I双酶切鉴定，鉴定为阳性的质粒送北京擎科生物科技有限公司测序，命名为pXJ41 -Myc-3D。

1.2.2Western blotting检测FMDV 3D蛋白的表达

将HEK-293T细胞接种于6孔板中进行培养，待细胞密度达到70%～90%时，用Lipofectamine3000转染试剂按说明书进行操作，转染质粒pXJ41-Myc-3D和pXJ41空载体各2ug。培养24h后，弃去上清，用等体积预冷的PBS洗涤细胞2次，将6孑L板置于冰上，加入细胞裂解液裂解细胞20min后，4℃12000r/min离心10min。取上清液与上样缓冲液混合后煮沸10min。将处理好的样品进行12% SDS-PAGE凝胶电泳后，采用湿法（100V，70min）将蛋白转印至NC膜。将NC膜转移至5%脱脂奶粉封闭液中，室温轻摇封闭1h，用一抗稀释液稀释的兔抗Myc和兔抗actin于4℃过夜孵育，二抗为用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物（HRP）标记的羊抗兔抗体，室温孵育1h，洗膜后用Sparkjade ECL super（极超敏化学发光试剂盒）显色，BIO-RAD凝胶成像仪进行曝光。

1.2.3IFA检测FMDV 3D蛋白的细胞定位用无菌镊子夹取细胞爬片置于24孔板内，接种PK-15细胞，待细胞密度达到40%～50%时，用Lipo-fectamine3000转染试剂按说明书进行操作，各孔分别转染质粒pXJ41-Myc-3D和pXJ41空载体各0.5ug。培养24h后弃上清，用4%多聚甲醛固定45min;PBS洗10minx3次后，加入0.1%TritonX-100室温通透30min;PBS洗10min×3次后，加入1：600稀释的鼠源Myc抗体室温孵育2h;PBS洗10minx3次后，加入1：1000稀释的Alexa Fluor488-羊抗鼠抗体，室温避光孵育1h：PBS洗10minx3次后，加入1：10000稀释的DA-PI室温孵育5min;PBS洗10minx3次后，取出爬片置于滴有抗荧光衰减封闭剂的载玻片上，封片后于荧光显微镜下观察3D蛋白在细胞内的定位情况。

1.2.4Luciferase检测FMDV 3D蛋白对IFN启动子的影响

将HEK-293T细胞接种于12孔板中进行培养，待细胞密度达到70%～90%时，用Lipofectamine3000转染试剂按说明书进行操作，分别转染pXJ41-Myc-3D和空载体pXJ41各0.4ug，同时分别转染IFN启动子报告基因质粒和内参质粒pRL-TK 0.04ug。24 h后感染水疱性口炎病毒（Versicular sto-matLtLs VLrUS，VSV）（MOI=0.1），10h后，按双荧光素酶报告基因试剂盒说明书方法收取细胞进行检测。

1.2.5Real-time PCR检测FMDV 3D蛋白对IFN-mRNA的影响将HEK-293T细胞接种于24孔板中进行培养，待细胞密度达到70%～90%时，用Lipofectamine⑩3000转染试剂按说明书进行操作，分别转染质粒pXJ41-Myc-3D和空载体pXJ41各0.5ug，24h后感染VSV（MOI=0.1），10h后，收集细胞使用RNA-easy Isolation Reagent试剂盒提取总RNA，以其为模板反转录得到cD-NA，以GAPDH作为内参基因检测IFN mRNA水平，Real-time PCR引物序列详见表2。

1.2.6Real-time PCR检测病毒拷贝数将HEK-293T细胞接种于24孔板中进行培养，待细胞密度达到70%～90%时，用Lipofectamine3000转染试剂按说明书进行操作，分别转染质粒pXJ41-Myc-3D和空载体pXJ41各0.5ug，24h后感染VSV（MOI=0.1），10h后，细胞及其上清反复冻融后，一部分用于病毒滴度检测；一部分使用RNA-easyIsolation Reagent试剂盒提取总RNA，以其为模板反转录得到cDNA，绝对荧光定量检测VSV拷贝数。

1.2.7TCID50测定病毒滴度将HEK-293T细胞接种于96孔板中进行培养，待细胞密度达到90%时，将1.2.6中的样品12000r/min离心10min后取上清，用2%细胞维持液按10倍梯度稀释，共10个梯度，每个梯度4个重复，将稀释好的样品加入96孔板中，每孔100uL，并设置8个孔加入等体积细胞维持液做阴性对照，观察并记录细胞病变情况，按照Reed-Muench法计算TCID50。

1.3数据统计与分析

使用GraphPad Prism 5软件对试验数据进行统计学分析。

2结果与分析

2.1pXJ41-Myc-3D真核表达质粒的构建及鉴定

以pMD18-T-3D克隆质粒为模板，PCR扩增获得3D基因。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳可见大小约1500bp的特异性目的片段，与预期大小相符（图1）。重组质粒pXJ41-Myc-3D经HindⅢ/Kpn I双酶切后得到预期大小的片段（图2），测序结果表明pXJ41-Myc-3D真核表达质粒构建成功。

2.2Western blotting检测3D蛋白的表达

经Western blotting检测到pXJ41-Myc-3D在HEK-293T细胞中成功表达，大小约55kDa左右（图3）。

2.3IFA检测FMDV 3D蛋白的细胞定位

IFA结果显示，FMDV 3D蛋白在PK-15细胞中的表達主要定位在细胞核内，细胞胞浆中也有少量表达（图4）。

2.4双荧光素酶报告基因检测FMDV 3D蛋白对IFN启动子的影响

双荧光素酶报告基因检测结果显示，VSV感染后，pXJ41-Myc-3D转染组的IFN启动子活性极显著低于空载体pXJ41转染组，表明FMDV3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN启动子活性（图5）。

2.5Real-time PCR检测FMDV 3D蛋白对IFNmRNA的影响

Real-time PCR检测结果显示，VSV刺激后，pXJ41-Myc-3D转染组的IFN mRNA表达水平极显著低于空载体pXJ41转染组，表明FMDV 3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN mRNA表达水平（图6）。

2.6FMDV 3D蛋白对VSV增殖的影响

Real-time PCR检测VSV拷贝数结果显示，pXJ41-Myc-3D转染组极显著高于空载体组（图7）。TCID50结果显示，pXJ41-Myc-3D转染组VSV TCID50明显高于空载体转染组（图8）。表明FMDV 3D蛋白通过抑制I型IFN的产生促进了VSV的复制。

3讨论与结论

口蹄疫是一种急性、高度接触性人畜共患传染病，我国主要以0型口蹄疫为主，A型口蹄疫呈点状散发，加之境外疫情传人的影响，给我国的畜牧业带来严峻的挑战。FMDV 3D蛋白作为RNA病毒依赖的RNA聚合酶，催化病毒RNA合成，在不同血清型中高度保守，且有研究表明3D在病毒复制早期产生，感染后1.5h首先检测到3D瞬时表达，在核仁中均匀分布。本试验成功构建了真核表达质粒pXJ41-Myc-3D，并在HEK-293T细胞中进行了表达验证。通过IFA检测到3D蛋白在PK-15胞核和细胞胞浆中都有表达，且胞核内表达明显，显示3D主要定位于细胞核，与毕研丽等的研究结果一致。

天然免疫又称先天性免疫或固有免疫，是机体对抗病毒感染的第一道防线，当病毒感染机体后模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原相关模式分子（pathogen associat-ed molecule patterns，PAMPs），激活下游信号通路，诱导产生I型IFN等细胞因子，进而启动免疫应答。PRRs家族包括Toll样受体（TLRs）、RIG-I样受体（RLRs）、Nod样受体（NLRs）．C型凝集素受体（CLRs），其中TLRs和RLRs主要识别病毒RNA。FMDV在长期进化中形成了一系列策略逃逸宿主的天然免疫，从而促进自身复制，维持对宿主的持续感染。已有研究表明，FMDV编码的多种蛋白可参与调控先天性免疫信号通路，例如Lb蛋白可以通过去除ISG15的泛素化阻断天然免疫的启动，裂解LGP2抑制IFN的表达。3C蛋白通过溶酶体路径降解蛋白激酶PKR，也能通过抑制NF-KB信号通路促进病毒复制。3A蛋白与RIG-I、MDA5和MAVS互作并抑制蛋白表达，抑制RLR介导的IFN产生。2B通过降解RIG-I和MDA5调节IFN信号通路。2B和2C蛋白协同作用，影响MHC-I复合物的形成，逃避机体的天然免疫。3B与RIG-I互作，抑制RIG-I介导的信号通路。本实验室前期发现FMDV3C通过阻断STATl/STAT2核易位来拮抗干扰素信号通路。FMDV L通过与sRNaseL的N末端结构域相互作用，抑制细胞凋亡，拮抗OAS/RNase L通路，抑制抗病毒天然免疫。有研究表明FMDV非结构蛋白3D作为一种反式作用元件调控TLR3信号通路的激活，促进TLR3通路介导的I型干扰素的产生。但天然免疫反应交错复杂，不同的PAMPs可能激活多条信号通路，通过不同分子間相互作用共同完成天然免疫应答。本试验选用HEK-293T作为研究细胞，由于该模式细胞中不含TLR3受体，可排除TLR3信号通路的影响，探究3D蛋白对I型IFN信号通路的作用。

水疱性口炎病毒是一种负链RNA病毒，属弹状病毒科水疱病毒属，是研究I型IFN信号通路常用的模式病毒，细胞感染VSV后可激活I型IFN信号通路。本研究采用VSV模拟病毒感染，通过双荧光素酶报告基因、Real-time

PCR及TCID50试验，发现3D蛋白能够通过抑制I型IFN信号通路的活化抑制先天性免疫，进而促进VSV的复制。

综上，FMDV 3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN启动子的活性和IFN mRNA水平，促进了VSV的复制，提示FMDV 3D蛋白是病毒抵抗先天性免疫的重要因子，为其在I型IFN信号通路的作用及机制研究奠定了基础。