胎鼠额叶皮质神经干细胞的分离培养与分化

刘 兵

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

欧 微

(长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院，湖北 荆州 434000)

刘洪涛

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

胎鼠额叶皮质神经干细胞的分离培养与分化

刘 兵

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

欧 微

(长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院，湖北 荆州 434000)

刘洪涛

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

目的：探索从胚胎小鼠额叶皮质分离培养神经干细胞的方法。方法：无菌条件下分离孕13～15d小鼠胚胎额叶皮质脑组织，经消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM/F12培养基，培养扩增；倒置显微镜观察比较生长状况；机械分离法传代；10%血清接种分化；免疫细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向，结果：培养的部分细胞体外分裂增殖，同时表达神经干细胞特异性抗原nestin， 并向神经细胞和胶质细胞分化。结论：小鼠胚脑存在具有多分化潜能的神经干细胞，它们能在体外稳定培养、传代和分化，为细胞替代治疗提供了理想的细胞来源。

神经干细胞；培养；分化；胎鼠

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是一类广泛存在于胚胎及成体中枢神经系统的早期未分化细胞，被认为是神经系统的“发源地”[1]。近年来随着对NSCs研究的深入，利用NSCs移植治疗神经系统损伤及退行性疾病越来越受到广泛的关注[2]。如何将神经干细胞在体外稳定培养、传代，不仅可以为体外研究神经干细胞的分化打基础，而且可以促进神经干细胞应用于细胞替代治疗的发展。本实验在无血清培养条件下，利用特定的生长因子使胎鼠NSCs稳定增殖传代并分化出神经元和神经胶质细胞，为进一步探讨小鼠胚胎NSC移植的临床研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 孕13～15d昆明小鼠(E13-E15 SPF级)由武汉大学实验动物中心提供。

1.1.2试剂与抗体 DMEM/F12培养基，特优级胎牛血清(FBS),B27均购自GIBCO公司(USA)；碱性成纤维生长因子(bFGF)购自Peprotech公司(USA); 胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚赖氨酸(PLL)和DAPI购自SIGMA公司(USA)。羊抗鼠anti-nestin，anti-NSE，anti-GFAP的单克隆一抗体及相应的荧光标记二抗均购自美国Alpha Diagnostic Intl.Inc公司；其余试剂均为市购。一次性培养皿(直径60mm)和24孔板购自美国Corning公司。

1.2方法

1.2.1神经干细胞的分离培养与分化 取孕13～15d昆明小鼠，断颈处死，75%酒精浸浴2min，无菌剖腹取出胚胎，浸于预冷0.01M PBS中，解剖显微镜下分离胎脑，PBS洗2次，剥尽脑膜，切取额叶脑皮质组织块(每次用胚胎6～8只)。将取下组织转移至试管中，予以0.25%胰酶(Trypsin)和DNA酶37℃恒温摇床(150rpm)消化5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吸管轻柔吹打制成单细胞悬液，1 000rpm离心10min,弃上清，以无血清DMEM/F12培养基再次重悬，200目尼龙网过滤，经台盼蓝染色计数后，调整细胞密度以3×105个活细胞接种于60mm培养皿中，加2%B27、10ng/ml bFGF于37℃ 5%CO2恒温培养箱中培养。细胞生长1周左右，采用机械方法分离传代细胞，离心弃上清液，重悬，计数接种。一般7d左右传代一次。取传2～3代的神经干细胞克隆,置入装有1%多聚赖氨酸处理过盖玻片的24孔培养板中,在仅在含有10%胎牛血清培养基中自然分化，均每2～3d换液，培养10d后收获细胞。

1.2.2免疫细胞化学鉴定 将神经干细胞用含血清培养基种植到多聚赖氨酸包被的载玻片上，对贴壁3h的神经球进行Nestin染色。对有血清培养1周的神经球进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色。检测方法如下：取出待检细胞，纯甲醇-20℃固定20min，PBS洗3次，每次5min，0.5%TritonX-100透化20min，PBS洗3次；3%H2O2和羊血清孵育封闭非特异性反应，PBS洗3次；一抗分别为Nestin.NSE.GFAP.4℃过夜，次日加入标记有Cy3荧光素或FITC荧光素的二抗，37℃孵育1h；PBS洗3次，缓冲甘油封片，日本OLYPUS显微镜和德国Lacai共聚焦显微镜拍片观察。

2 结果

2.1神经干细胞的分离培养和分化情况原代培养的皮质干细胞在含B27及bFGF的无血清培养基中培养，早期胞体较小，圆形，未见突起，光镜下折光性好，晶亮；24h可见大部分细胞沉底，无突起，由于取材仅限额叶皮质细胞间比较干净；36h可见沉底的细胞形成5～10个细胞的聚集体；2天可见聚集体增大，悬浮，形成十几个细胞的神经球(neurosphere)(见第77页彩色图版Ⅰ之图1),以后细胞球继续增大，5～7d细胞球直径可达20～25μm(×100)，此时神经球约50～100个/cm2, 球体均匀致密，细胞晶莹透亮，周边可见明显分裂相细胞；继续生长球体增大，中央出现黄褐色，为营养缺乏所致。也提示需立即传代处理。皮质NSCs传代培养生长性状基本同原代。将培养的神经球移入含有血清的培养基中，3h即可看到细胞贴壁，12h即可看到细胞球呈放射状的生长并伸出细长突起，随着时间延长突起也延长增多、球体之间形成纤维网络；3d左右形态明显的神经细胞和胶质细胞从贴壁细胞球迁移出来，有长突起和网状神经纤维联系，皮质神经球体2周左右可完全分化为神经细胞和胶质细胞。

2.2皮质神经干细胞球分化后细胞类型的鉴定胚鼠额叶皮质体外培养的原代及传代形成的神经球经免疫荧光染色显示神经球细胞表达巢蛋白(nestin)抗原呈阳性(见第77页彩色图版Ⅰ之图2)，表明它们属于神经干细胞。对神经球分化14d的子代细胞进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色，可见NSE和GFAP免疫荧光阳性细胞(见第77页彩色图版Ⅰ之图3、图4)，说明神经干细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞，具有多向分化的潜能。

3 讨论

神经干细胞是一种具有自我更新及多向分化潜能的细胞。它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs存在胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统的若干区域。在成年哺乳动物和晚期胚胎中，NSCs 存在的部位和数量都较少，而在早期胚胎中枢神经系统中NSCs则广泛存在。因此取孕13～15d胚鼠额叶皮质组织培养得到NSCs成功率较高，易获得大量高纯度的NSCs。

本实验在DMEM/F12培养基中添加bFGF促进神经干细胞的增殖和分化。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是少突胶质细胞、施万细胞和星形胶质细胞的致有丝分裂原，也能促进各种神经组织前体细胞的增殖和分化。不仅如此，bFGF的添加浓度和增殖效应密切相关。开始时随着因子浓度的增加，细胞增殖的速度亦随之加快，当bFGF浓度达到10～20ng/ml时，细胞增殖达较高水平,之后随着bFGF浓度增加，细胞增殖速度反而下降。因此本实验中bFGF的添加浓度是确定在20ng/ml。另一添加成分B27是培养基添加剂的混合液。B27是一种很强的抗氧化、无血清培养基添加成分，它在神经元粘附于基质时能提供必要的一些血清成分。在本实验中,通过摸索发现20μg/L 碱性成纤维生长因子,2% B27组合可以很好的促进皮质神经干细胞的存活与增殖。

Nestin是目前公认的神经干细胞的标志物[3]。本组实验对来源于胚鼠额叶皮质的神经干细胞成功地进行了培养和传代。培养的神经干细胞形成神经球，这是神经干细胞悬浮培养的重要特征。神经球表达Nestin这种特异性的标记物，以及能分化为神经元和星形胶质细胞细胞，证实了其干细胞属性。继续培养神经球进一步分化成一些有突起细胞,渐有突起增长,相互连接成网的现象出现,还有的细胞脱离细胞球而逐渐分化发育为较成熟的、可表达NSE、GFAP抗原的有突起的细胞,提示额叶来源的神经干细胞具有分化为神经元和神经胶质细胞的潜能。在体外细胞培养过程中,神经球生长到一定程度,中央的神经干细胞会因缺乏营养因子的调控而死亡。因此在培养一定时间后,需要分散神经球或传代来保持细胞的活性。本实验尽量使用机械分离法和酶消化法进行分散过大的细胞团块或神经球获取活力较强的细胞。

总之，如果通过体外培养的方法寻找促使神经干细胞增殖和分化的物质,能促进内源性神经干细胞的自身增殖,应用于临床治疗,将对神经系统损伤的治疗带来新的光明。因此,建立分离、培养和鉴定神经干细胞的方法，为神经干细胞的深入研究及其应用奠定基础。

[1]Gage FH.Mammalian neural stem cells[J].Science，2000，287：1433-1435.

[2]朱剑虹.神经干细胞和人脑再生医学[J].中华医学杂志，2005，85(3)：2527-2529.

[3] Lendahl U, Zimmerman LB, Mckay RDG.CNS stem cell express a new class ofintermediate filament protein[J].Cell，1990，60：585-595.

[编辑] 一 凡

2009-05-13

刘兵(1973-)，男，湖北荆州人，讲师，硕士，从事神经生物学和断层解剖学教学与研究工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.03.004

R322.83

A

1673-1409(2009)03-R008-03