乳腺癌组织中浸润树突状细胞及其表面分子表达的研究*

王洪江，孙尚韶，宋 墨，姜 伟，李克军，王忠裕

(大连医科大学 附属第一医院 普外科， 辽宁 大连 116011)

近年来研究发现[1,2]乳腺癌发生、发展与机体的免疫状态特别是树突状细胞的关系十分密切。树突细胞表面的MHCⅠ、Ⅱ类分子、共刺激分子及免疫黏附分子低表达或不表达以及肿瘤细胞分泌的IL-10、TGF-β1、VEGF等免疫抑制因子可能是树突细胞抗原提呈功能障碍，导致肿瘤细胞的免疫逃逸，加重肿瘤细胞浸润及出现转移的原因之一。本实验通过乳腺癌及其周围组织中浸润树突状细胞(tumor infiltration dentric cell，TIDC)及其表面分子表达的检测，对乳腺癌患者局部免疫情况进行了研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 标本采集：收集大连医科大学附属第一医院普外科2008年11月～2008年12月收治的乳腺癌病人26例，均为女性，年龄32～76岁，中位年龄51.1岁。所有患者术前均未经放、化疗，均行乳腺癌改良根治术，术后病理证实为浸润性导管癌。标本采集均在手术标本离体30 min内进行，每例患者均取肿瘤及癌旁正常腺体组织，标本迅速置于-80℃冰箱中冻存。

1.1.2 实验试剂：实验中的免疫组化试剂，如鼠抗人CD1a单克隆抗体、鼠抗人CD83单克隆抗体、鼠抗人CD54单克隆抗体、兔抗人S-100蛋白单克隆抗体、SP试剂盒和DAS染色试剂盒、即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒，均购于北京中杉生物技术开发有限公司；阳性对照由北京中杉生物技术开发有限公司提供的切片；阴性对照使用PBS代替一抗，购于北京中杉生物技术开发有限公司。TRIZOL Reagent、cDNA第一链合成逆转录试剂盒、β-actin、IL-10、TGF-β1、VEGF A引物、100 bpDNA ladder marker均购于或由日本TaKaRa公司大连分公司合成。PCR扩增仪：美国MJResearch公司；压电泳仪：EC Appotatus corporation；凝胶成像系统：Hema凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)。

1.2 实验方法

1.2.1 标本处理：手术切取乳腺癌和癌周新鲜标本,取其一部分经10%甲醛固定,制成石蜡切片,行免疫组化染色;另一部分用于分离乳腺癌组织和癌周组织单细胞悬液，用于提取总RNA,采用RT-PCR方法从mRNA水平检测乳腺癌细胞中IL-10、TGF-β1及VEGF-A基因的表达。

1.2.2 免疫组化染色及结果判定：乳腺癌及癌周标本组织切片厚度为4 μm,常规脱蜡、水化后,3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复,按即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒说明书操作。一抗采用鼠抗人S-100单克隆抗体,设阳性对照和阴性对照,以试剂盒中提供的阳性切片做阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。采用DAB染色,HE复染。S-100阳性树突细胞以细浆内出现棕黄色信号；CD1a阳性树突细胞主要以细胞间质和胞膜内出现棕褐色信号；CD83阳性树突细胞以细胞间质和细胞膜内出现棕黄色信号；CD54阳性树突细胞主要以胞膜、胞浆出现明显染色的细胞。肿瘤组织中的浸润程度根据Furukawa等提出的分级标准：在低倍镜(×100，Olympus双目显微镜) 下选取癌细胞密集区，更换高倍镜(×400) ，计数10个高倍视野内阳性细胞的总数，0～20个阳性细胞为阴性；>20个细胞为阳性表达。

1.2.3 乳腺癌组织中IL-10、TGF-β1、VEGF基因的检测：从-80℃冰箱取出组织标本，切取一小块，约50 mg，提取RNA后，鉴定RNA纯度，用RNA逆转录，合成第一链cDNA，以下列引物作为PCR的模版分别检测乳腺癌及癌周组织中的IL-10、TGF-β1、VEGF mRNA，在凝胶成像系统紫外线灯下中，观察PCR扩增产物条带并记录图像。引物设计采用Primer 5和Oligo 6引物设计软件设计，所有引物均由日本TaKaRa公司大连分公司合成，β-actin上游引物： 5’-GGGACCTGACTGACTACCTC-3’、β-actin下游引物：5’-ACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’；IL-10上游引物：5’-TCAGGGTGGCGACTCTAT-3’、IL-10下游引物：5’-TGGGCTTCTTTCTAAATCGTTC-3’；TGF-β1上游引物：5’-CGGAGTTGTGCGGCAGTGGTTGAG-3’、TGF-β1下游引物：5’-GGCGCCCGGGTTATGCTGGTTGTA-3’；VEGF上游引物：5’-ATGGCAGAAGGAGGAGGG-3’、VEGF下游引物：5’-CGAACCCTGAGGGAGGCT-3’。RT-PCR结果判断：β-actin产物长度为546 bp、IL-10产物长度为199 bp、TGF-β1产物长度为448 bp，VEGF产物长度为420 bp，PCR产物扩增条带出现在目的条带区，即判定为表达阳性。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 13.0 统计软件包进行统计学分析。计数资料比较采用卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌及癌周组织中树突状细胞的表达情况

S-100+TIDC可见细浆内出现棕黄色信号(图1a)，乳腺癌组织中S-100+TIDC的浸润数量明显比对照癌旁组织数量减少；26例乳腺癌组织中S-100+TIDC的表达为4例，阳性率15.4%;癌旁组织中S-100+TIDC表达分别22例,阳性率84.6%，明显高于乳腺癌组织(P<0.05)。

2.2 乳腺癌及癌周组织中树突状细胞的CD1a、 CD83及CD54的表达

观察乳腺癌组织中树突状细胞表面分子的免疫组化染色可见细胞间质和胞膜内出现棕褐色的CD1a+TIDC(图1b)、细胞间质和细胞膜内出现棕黄色CD83+TIDC(图1c)和胞膜，胞浆出现明显染色的CD54+TIDC(图1d)。26例乳腺癌组织和癌旁组织的CD1a+TIDC、CD83+TIDC和CD54+TIDC的表达情况见表1。 癌旁组织的CD1a+TIDC、CD83+TIDC和CD54+TIDC的阳性表达明显高于乳腺癌组织，其差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图1 乳腺癌组织中树突状细胞S-100、CD1a、 CD83及CD54的表达(×400)

CD1a阳性例数%CD83阳性例数%CD54阳性例数%乳腺癌组织519.2519.200癌旁组织2284.62180.81869.2

2.3 乳腺癌及癌周组织中免疫抑制因子IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA、VEGF A mRNA表达的检测

26例乳腺癌组织和癌旁组织中均有β-actin的表达，阳性率为100%；IL-10 mRNA、 TGF-β1mRNA和VEGF A mRNA的表达见图2、表2。乳腺癌组织中的IL-10 mRNA、TGF-β1mRNA、VEGF A mRNA表达阳性率均明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 免疫抑制因子的检测由左至右条带区单数为乳腺癌、双数为癌旁组织、最右侧为Maker带

IL-10mRNA阳性例数%TGF-β1mRNA阳性例数%VEGFAmRNA阳性例数%乳腺癌组织2076.92076.91765.4癌旁组织726.9726.9311.5

3 讨 论

树突状细胞是目前的功能最强的抗原提呈细胞[3]，具有捕获、提呈抗原和致敏初始型T细胞的功能。成熟DC高表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子和共刺激分子及黏附分子，具有较强的抗原提呈和激活初始型T细胞能力。其抗肿瘤机制是树突状细胞对肿瘤抗原的摄取，即摄取抗原后树突状细胞发育成熟，膜表面的MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子和共刺激分子和黏附分子形成复合物，向T细胞内传递信号，促进T细胞的激活。同时也可分泌大量的IL-12，诱导T细胞、自然杀伤细胞、淋巴因子激活杀伤细胞产生大量TNF-γ、穿孔素和颗粒酶，增强对靶细胞的溶解作用。因此，肿瘤组织中DC发挥抗原提呈功能受DC数量、表面分子的表达和免疫抑制因子等多种因素的影响。

文献报告多数肿瘤组织中浸润树突状细胞的数量和功能，与肿瘤生物行为和预后密切相关[4-6]。Kichles-lakomy等[7]发现早期乳腺癌患者体内树突状细胞表达CDla、CD83、CD80、CD86、CD54明显低于健康对照组，激活T淋巴细胞能力比健康对照组明显减弱。李艳萍等[8，9]研究发现乳腺癌组织肿瘤浸润性DC主要集中于癌周和癌旁，癌灶内的树突状细胞则分布较少，细胞形态不规则，表面可见长、短不等，粗细不一和数目不等的突起，其突起与癌细胞密切接触，启动抗肿瘤免疫。本实验通过免疫组化染色对26例乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织进行分析也有相似的结果：乳腺癌组织中树突状细胞的浸润数量比癌旁组织数量明显减少，乳腺癌组织中S-100+TIDC阳性率仅为15.4%;癌旁组织则高达84.6%，说明肿瘤组织中存在肿瘤浸润性DC的数量减少，因此导致机体免疫功能低下，可能成为促进肿瘤的发生、发展的原因之一。

TIDC可表达多种表面分子，主要包括CD1、CD4、CD33、CD44、CD80及主要组织相容性复合物-I、II类分子等。这些表面分子使DC能够迅速地对微环境中的改变做出反应，摄取各种各样的免疫原性分子。此外，还需要其表面表达的共刺激分子、黏附分子的参与，才能完成抗原提呈能力。作者通过免疫组化方法对乳腺癌TIDC的表面分子及共刺激分子、黏附分子的表达进行了分析，结果表明，26例患者中有5例肿瘤组织中有CD1a+、CD83+TIDC的表达、且均不表达CD54+TIDC，提示TIDC是一种功能低下或无功能的DC，无法有效地识别和杀伤肿瘤细胞，可能是TIDC无法有效诱导抗原特异性CTL反应的原因之一。

造成TIDC功能低下或无功能的原因，多数学者认为是肿瘤细胞释放的免疫抑制因子作用于DC所致，导致其表面分子的表达和功能发生变化。基础研究表明，抑制浸润树突状细胞的成熟和迁移的因子主要有IL-10、TGF-β1、VEGF、IL-12等，是可能造成浸润树突状细胞表型异常及功能低下的原因之一。IL-10、VEGF及TGF-β1均为免疫抑制因子，能够抑制抗原提呈细胞的免疫功能。Allavena等[10]研究表明IL-10能降低DC的表面分子如MHC-II、CD80及CD86等的表达率，抑制DC的分化成熟，抑制DC的抗原提呈能力。而IL-10的分泌又受TGF-β的影响，TGF-β的存在可明显促进IL-10的分泌。应用抗体阻断法证实TGF-β对抗原提呈细胞功能的影响是通过IL-10实现的，而且TGF-β1可下调MHC-II类分子的表达。VEGF是一种重要的血管生成刺激因子，由肿瘤细胞释放，抑制树突状细胞成熟，导致肿瘤逃避机体的免疫监视。研究发现VEGF可在DC成熟过程的早期影响造血前体细胞分化为功能成熟的DC[11]。Mitsuhiko Iwamoto等[12]的研究认为，VEGF可以抑制CD34+前体细胞分化为功能成熟的DC,肿瘤浸润性DC的数量与VEGF表达呈负相关,VEGF在抑制肿瘤微环境中肿瘤浸润性DC的成熟过程中发挥着关键作用。Iwanoto等[12，13]研究了130例乳腺癌患者浸润树突状细胞，发现CD83+浸润树突状细胞与长期不复发和生存率有显著关系。并分析得出CD83+浸润树突状细胞浸润与VEGF的表达呈负相关，其结论在肿瘤内有CD83+浸润树突状细胞是调控肿瘤免疫的重要因素。Takahashi等研究了人类胃癌组织中浸润树突状细胞与VEGF-C的相关性，发现树突状细胞在肿瘤中数量与VEGF-C的浸润呈负相关。本研究结果显示乳腺癌组织均有IL-10 mRNA、TGF-β1mRNA、VEGF A mRNA高水平的表达，而癌旁组织中表达水平很低或无表达，说明乳腺癌组织局部有多量的免疫抑制因子存在，这些免疫抑制因子单独或联合作用可能造成树突状细胞表面的MHCⅠⅡ类分子、共刺激分子、免疫黏附分子低表达或不表达的原因之一，从而降低树突状细胞抗原提呈功能，导致肿瘤细胞的免疫逃逸[12]。

因此，乳腺癌组织中浸润性树突状细胞数量减少， IL-10、TGF-β1、VEGF等免疫抑制因子高表达以及乳腺癌中树突状细胞的MHC-Ⅱ类分子、黏附分子和共刺激分子等表面分子低表达或不表达，致使浸润性树突状细胞的抗原提呈功能受抑制，使肿瘤细胞免疫逃逸。进一步研究肿瘤微环境中TIDC表型及功能状态变化的原因，有助于深入认识肿瘤免疫逃逸机制。

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