DNMT1与UHRF1基因在胃癌细胞系中的表达特点及其与癌细胞DNA甲基化的关系*

王雪娇，张开立，王宏宇，胡先福，李世杰，王 茜，李 宏，孙 媛

(1.大连医科大学 临床医学系2007级; 2.辽宁省癌症基因组重点室及大连医科大学 细胞生物学教研室，辽宁 大连 116044)

胃癌(gastric cancer)是人体常见的恶性肿瘤[1]，其发病率有着明显的地域性，在中国有包括大连在内的多个胃癌高发区并且胃癌总发病人数约占世界总发病人数的41%[2]。因此，了解胃癌发生、发展及转移机制，制订出适合本地区胃癌预测、早期诊断和早期阻断的有效措施极为迫切。

胃癌的病因复杂，其发生发展是一个多因素参与的多阶段复杂过程，涉及遗传学(Genetics)与表观遗传学(Epigenetics)的改变。DNA甲基化是最主要的表观遗传学修饰方式之一。大量证据表明，肿瘤的发生与抑癌基因启动子区异常高甲基化有关[3]。

在以往的工作中，作者对胃癌四个细胞系 MGC 803， BGC823，AGS， HGC-27的多基因多位点DNA甲基化特点(也称CpG岛甲基化表型，CpG Island Methylator Phenotype，CIMP)进行比较鉴定，结果发现MGC 803，BGC 823，AGS， HGC-27中的CIMP型依次为L， L， L和H。说明胃癌细胞系发生了不同程度的甲基化。但导致其不同程度甲基化的原因仍不清楚。

甲基转移酶1(DNMT1)可以在模板链的指导下，使半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化[4]。近年的研究亦发现甲基化与UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，也称为ICBP90)基因负责编码一类指环型E3泛素酶的亚家族成员有关[5，6]。

而有关胃癌细胞系中的 CIMP 型，与 DNMT1及 UHRF1的相关研究未见报道。本研究拟对上述研究进行分析，探讨胃癌细胞表观遗传学改变的分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞系

实验所需胃癌细胞系AGS和HGC-27购于中国科学院细胞库。MGC803(人胃低分化黏液癌)和BGC823(人胃低分化癌)从北京肿瘤研究所引进。细胞用含10%胎牛血清,0.2%碳酸氢钠和0.3% HEPES的DMEM培养液(Gibco,USA)加青霉素100 U/mL,链霉素100 U/mL在37℃ 5%二氧化碳和100%湿度的孵箱中培养至对数生长期。用0.25%胰蛋白酶和0.04% EDTA的无钙，镁离子的PBS混合液消化处理细胞，重悬细胞于培养液中，进行细胞计数。调整细胞密度，以2×105个/mL的密度分装到含有培养液(pH7.2)的细胞培养皿中，混匀，将细胞悬液均匀铺在培养皿中。对培养细胞的RNA提取与分析按下述实验步骤进行。

1.2 RNA提取及RT-PCR

收集各实验组的细胞，分别置于1.5 mL的离心管中，用Trizol试剂提取总RNA进行RT-PCR。

1.2.1 RNA提取：在每个装有收集好细胞的Eppendorf管中加入200 μL TrizoL，摇匀，-20 ℃消化1 h；加入40 μL氯仿，轻轻震荡15 s；室温静置3 min；离心(4℃，15 min×12000 g)；吸上清至新管同时加入100 μL异丙醇，摇匀，室温静置15 min；离心(4 ℃，10 min×12 000 g)，弃上清，用75%乙醇洗沉淀；离心(4 ℃，5 min×10 000 g)，弃去上清，晾干后用1‰ DEPC水20 μL溶解RNA；260 nm波长下测定总RNA浓度。

1.2.2 反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)：反转录体系20 μL，含模板RNA 0.5 μg；依照TaKaRa RNA LA PCRTMKit试剂盒提供说明书进行操作，反应条件为：55 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min；PCR反应体系15 μL，其中含：反转录液3 μL，MgCl20.9 μmol/L，10×LA PCR Buffer 1.2 μL，引物终浓度为0.225 μmol/L，TaqDNA聚合酶0.067 U，加水至15 μL。PCR反应条件：UHRF1引物序列(TaKaRa生物工程有限公司)： 上游: 5’-GTC GGA TCA TCT TCG TGG ACG-3’；下游:5’-CTG TTC CGC GGT CCT CTT GTT-3’[7]。95 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s，32个循环，扩增片段长度为680 bp。DNMT1引物序列(TaKaRa生物工程有限公司)：上游： 5’- ACC GCT TCT ACT TCC TCG AGG CCT A -3’，下游：5’- GTT GCA GTC CTC TGT GAA CAC TGT GG -3’[8]；反应条件94 ℃ 预变性2 min，94 ℃ 35 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共循环35次，然后延伸72 ℃ 5 min; 扩增片段长度为335 bp，内参为β-actin。

扩增产物直接加入3 μL 6×溴酚蓝载样缓冲液混匀，2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像，并进行密度分析，观察各组目的基因的表达情况。

1.3 统计学方法

所有数据用mean±SD标准差表示，采用单因素方差分析，对各组均数进行统计学分析，以P<0.01为差异有显著性意义。

2 结 果

RT-PCR结果显示，CIMP型不同的4个胃癌细胞系中DNMT1，UHRF1表达有所差异。DNMT1在CIMP-L型的MGC803和AGS中的表达水平较低，但在CIMP-L型BGC823和CIMP-H型HGC-27中明显增加。与MGC803和AGS比较差异有显著性意义(P<0.01)，DNMT1表达水平与CIMP型鉴定结果并不一致(图1、表1)。而UHRF1在HGC-27中有高水平表达,与其他3个胃癌细胞系比较差异有显著性意义(P<0.01),其表达水平与CIMP型基本一致(图1、表1)。

图1 4个胃癌细胞系中DNMT1与UHRF1表达特点及CIMP型鉴定结果

表1 4个胃癌细胞系中DNMT1及UHRF1的RT-PCR结果(与β-actin IOD的比值)

DNMT1UHRF1MGC8030.5271±0.02340.5151±0.0157BGC8230.9518±0.02551)2)0.5130±0.0223AGS0.5403±0.03900.5026±0.0240HGC-270.9179±0.04491)2)0.8066±0.01041)2)3)

1)与MGC803相比，P<0.01; 2)与AGS相比，P<0.01;3)与BGC823相比，P<0.01

3 讨 论

胃癌是世界最常见恶性肿瘤之一。癌细胞的侵袭和转移是影响其预后和疗效的主要因素。侵袭性和转移性是肿瘤细胞最为重要的生物学行为，涉及黏附、降解、运动和增殖过程，并经由淋巴道、血道或腔道转移至靶器官和组织。这个复杂过程的完成，需要多种因子参与和相互作用，涉及遗传学与表观遗传学改变。其中DNA甲基化是表观遗传学修饰的主要方式，其所致异常基因沉默与多数肿瘤发生有关。

DNA甲基化是表观遗传学修饰的最主要方式。它是在DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用下，以S腺苷蛋氨酸(SAM)为供体，将甲基基团转移到胞嘧啶的第5位C原子上而形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化具有序列特异性，主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上。通常情况下，基因组中的多数基因(包括全部管家基因和部分组织特异性基因)的5’启动子区域富含CpG序列，称为CpG岛。其甲基化状态直接影响基因的表达，这也是基因表达调控的重要方式之一。

一般而言，DNA甲基化会抑制基因的表达。发生在基因启动子或其附近区域的甲基化将直接阻碍AP-2、c-Myc、E2F和NF-κB等转录因子与启动子的结合，使基因不能转录或降低基因的转录水平。 同时，基因5’端的调控元件发生甲基化后能结合特定甲基化CpG序列结合蛋白(methyl CpG binding protein, MBP)，从而间接阻止转录因子与启动子形成转录复合体。此外，甲基化还可以通过改变染色质的构象使染色质凝缩成非活性的高级结构[9]。因此，DNA甲基化可以导致基因沉默(gene silence)，去甲基化(demethylation)可以作为一个沉默基因重新激活(reactivation)的开关[10]。

在表观遗传学(epigenetics)研究中，基因启动子区CpG岛甲基化与肿瘤的发生发展有着极为重要的密切关系，特别是抑癌基因的CpG岛甲基化问题在近年来愈来愈受到重视[11]。研究认为，异常甲基化与肿瘤的发生密切相关。DNA甲基化状态的改变直接影响了抑癌基因表达、基因组的稳定性，并且与基因突变有关。

DNA甲基转移酶(DNMTs)催化DNA甲基化的发生与维持，在有DNA异常甲基化机制参与发生的肿瘤细胞中常为过度表达。在以往的工作中，我们对胃癌四个细胞系 MGC803， BGC823，AGS， HGC-27的多基因多位点DNA甲基化特点(也称CpG岛甲基化表型，CpG Island Methylator Phenotype，CIMP)进行比较分析，共选择p16，hMLH1，TIMP-3，MINT2和RASSFIA共5个位点进行甲基化检测并将之分为三级：如果发现其中3～5个loci发生甲基化，则定义为CIMP-H；发现1～2个loci发生甲基化，则定义为CIMP-L；如果这5个位点没有一个发生甲基化则定义为CIMP-N。结果发现MGC803，BGC823，AGS， HGC-22中的CIMP型依次为L，L，L和H。说明胃癌细胞系发生了不同程度的甲基化。本研究对胃癌细胞系中DNMT1的表达情况进行分析，发现在4种细胞系中，DNMT在BGC823和HGC-27中都高表达(P<0.01)，与CIMP型鉴定结果并不一致，即在DNMTs基因高表达的BGC823细胞系中，作者并没有检测到有多位点异常高甲基化的特征。这是否意味着存在其他甲基化调控机制的可能性？这种潜在的调控因素通过与DNMTs共同作用影响来保证甲基化状态在DNA复制过程中的维持。因此，本研究进行进一步的探讨。

UHRF1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，也称为ICBP90)基因负责编码一类指环型E3泛素酶的亚家族成员。一般认为UHRF1可以通过编码蛋白与特定的DNA序列结合，进一步召集组蛋白去乙酰化酶影响染色质的结构而发挥基因表达调控作用。近年来有学者指出，UHRF1蛋白具有一个甲基化DNA的结合区域——称作SRA(SET and RING associated)域[5]。在DNA复制过程中，UHRF1蛋白对DNA甲基化状态的维持发挥关键性作用——它可以识别半甲基化的DNA子链，并召集DNA甲基转移酶1聚合在DNA链上，将半甲基化DNA双链转变成完全甲基化DNA。从而使得DNA甲基化状态在复制和传代过程中得到维持。

作者发现胃癌细胞系中UHRF1表达特点为只在HGC-27中高表达，而在MGC803、BGC823及AGS中表达程度较低(P<0.01)，与CIMP型鉴定结果基本一致，提示UHRF1的表达是DNMT1进行甲基化的重要环节，UHRF1和DNMT1的同时高表达可能是胃癌甲基化程度高的主要原因。

本研究成果不仅从理论上可以对DNA甲基化发生和维持的分子机制加以补充和完善，而且提供了一个非常重要的表观调控关键分子UHRF1，对临床肿瘤表观遗传干预具有非常重要的指导意义——为高发区胃癌的病因学分析以及临床疾病预测、预防和治疗提供重要的生物学指标。

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