清络方活性部位的化学成分研究

郑顺亮， 李开通， 杨 帅， 张艺轩， 石 钺

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193)

清络方由苦参、青风藤、黄柏组成，为新安名医“张一贴”的祖传方药，是基于中医“络病”理论，针对类风湿性关节炎“湿热阻络证”的代表方剂，功擅清热除湿、通络开痹，临床上用于早、中期类风湿性关节炎的治疗。前期研究工作发现，清络方能显著减少滑膜毛细血管增生、防止血管翳形成，改善软骨破坏、减轻滑膜细胞亢进的分泌功能及代谢活性，并能够显著减少CIA大鼠滑膜组织中MMP3mRNA的合成，从而矫正、防治“络道亢变”所致的“血管新生”［1］，该研究被认为是目前进行中医方剂与血管增生的较早研究之一［2］。我们对清络方进行了提取分离，结合活性筛选，确定了其抑制血管新生的活性部位，为阐明其发挥药效的物质基础，本研究对活性部位进行系统分离，已经获得并鉴定结构的化合物为:β－谷甾醇、正二十六烷酸、石虎柠檬素A、黄柏内酯、苦参碱、槐果碱、尖防己碱、青藤碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、尖防己定碱、胡萝卜苷、三叶豆紫檀苷、巴马汀、小檗碱、丁香苷、丁香脂素－4，4′－O－双－β－D－葡萄糖苷。其中石虎柠檬素A和正二十六烷酸属首次在组成清络方的三味中药苦参、青风藤、黄柏中发现，根据结构类型和生源途径判断石虎柠檬素A很可能来源于黄柏，正二十六烷酸来源于苦参。

1 仪器与试剂

Fisher－Johns显微熔点测定仪(未校正，美国);TU－1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);FTIR－8400S型红外光谱仪(KBr压片，日本);Bruker AVANCE DRX－500型核磁共振仪;VARIAN INOVA－500型核磁共振仪;Magnet质谱仪;SENCO－R型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);KQ－100型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);ZF－C型三用紫外灯(上海强运科技有限公司)。

薄层层析和柱层析硅胶(青岛海洋化工厂出品);Sephadex LH－20(美国GE公司出品);中性氧化铝(温州市东升化工试剂厂出品);聚酰胺薄膜(浙江四青生化材料厂出品)。所用化学试剂均为分析纯。

清络方组方中各单味药均购自北京同仁堂京北药店，原植物学名经中国医学科学院药用植物研究所标本馆李国强博士鉴定。苦参为豆科槐属植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，青风藤为防己科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.干燥藤茎，黄柏为芸香科植物黄檗Phellodendron amurense Rupr.(关黄柏)的干燥树皮。

2 提取分离

根据清络方配方比例，取全方共6.8 kg，70%乙醇回流提取2次，每次1 h，提取液滤过，回收乙醇，得浸膏。加水分散，上大孔吸附树脂，分别用水和稀乙醇进行洗脱，得到水洗脱部分和稀醇洗脱部分。

取稀醇洗脱部分100 g进行硅胶(200～300目)柱层析，二氯甲烷－甲醇不同比例梯度洗脱，按每流份100 mL收集，经薄层色谱检识合并相同流份，得到8个部分。对其中第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部分又分别进行硅胶(300～400目)柱层析，用二氯甲烷－甲醇不同比例梯度洗脱，Ⅱ:4～7份放置析出结晶，得到化合物1;Ⅲ:81～94份再进行硅胶(300～400目)柱层析，用二氯甲烷－甲醇不同比例梯度洗脱，得到化合物2和3;95～99份作相同处理，得到化合物4，其余合并，回收至小体积，氧化铝柱层析，乙酸乙酯－无水乙醇－三乙胺(200:1:0.5洗脱)，得到化合物5和6;100～118份作相同处理，得到化合物7、8、9和10;Ⅳ:119～153份作相同处理，得到化合物11、12和13;Ⅴ:156～171份合并，回收至小体积，硅胶制备薄层层析，二氯甲烷－甲醇(88:22)展开，得到化合物14;156～171份放置后析出沉淀，反复重结晶，得到化合物15;119～153份硅胶柱层析，二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，得到化合物16;Ⅵ:200～213份合并回收至小体积，上Sephadex LH－20凝胶柱，甲醇洗脱，回收至小体积，放置后析出沉淀，反复重结晶，得到化合物17。

3 鉴定

化合物1:白色片状结晶(甲醇)，mp 134～136℃。Liebermann－Burchard 反应呈阳性。EI－MS m/z:414(M+)，396(M+－H2O)。以上数据与文献［3］报道相同，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为 β－谷甾醇(β－sitosterol)。

化合物2:白色无定形粉末，mp 72～73℃。IR(KBr)cm－1:2 500 ～3 400(OH)，2 955(C－H)，2 918(C－H)，2 849(C－H)，1 707(C=O)，1 464，719。EIMS m/z:396(M+)，368(M+－CO)，354，185，129，73，60，符合饱和长链脂肪酸裂解规律。1H－NMR(CDCl3)δ:2.35(2H，t，J=7.5 Hz，α－CH2)，1.63(2H，m，β－CH2)，1.25 ～1.30(44H，br，CH2×22)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，长链端基 CH3)。13C－NMR中，δ179.0示有羧基，δ14.1示1个甲基，δ 22.7～δ33.9为长链中的多个亚甲基碳信号。以上数据与文献［4－5］报道一致，故确定为正二十六烷酸(hexacosanoic acid)。

化合物3:无色针状结晶(甲醇)，mp 289～291℃。EI－MS:502(M+)，487(M+－CH3)，485(M+－OH)，445，415，347，332，248，235，168，147，135，109，91，69，55。该化合物光谱特征和化合物 4(黄柏内酯)很相似，其差异在于17位取代基是半缩醛结构的不饱和结构的五元内酯，1H－NMR中22位氢的化学位移值6.29是单峰，可推断与母核相连的五元内酯环为结构片段Ⅰ(若为结构片段Ⅱ，则22位氢的化学位移值应在更低场，约7.30);δ8.15(1H，br.s)为与21位碳相连的羟基的氢信号，δ6.08(1H，br.s，H－21)，δc:169.0(C－23)，20 位碳的化学位移δc是163.7，在如此低场，可佐证与母核相连的五元内酯环为结构片段Ⅰ，也可推出双键与羰基共轭效应;δ122.1(C－22)，δ98.2(C－21)。1H－NMR 数据见表1，13C－NMR数据见表2。以上数据与文献［6］报道一致(表1和表2)，故确定石虎柠檬素A(shihulinmonin A)。见图1。

图1 石虎柠檬素A化学结构式

表1 化合物3和4的1H-NMR数据

化合物4:无色透明方晶(甲醇)，mp 292～294℃。10%硫酸乙醇显色为紫红色。EI－MS m/z:470(M+)，455(M－CH3)，413，358，347(基峰)。1HNMR、13C－NMR 等数据(见表 1 和表 2)与文献［7－8］报道一致，故确定为黄柏内酯(obaculactone)。

化合物5:白色针状结晶(石油醚)，mp 75～77℃。Dragendorff’sreagent反应显阳性。UV(MeOH):211 nm。1H－NMR中显示苦参碱型生物碱δ4.40(1H，dd，J=12.5，4.0 Hz，He－17)、δ3.05(1H，t，J=12.5 Hz，Ha－17)和 δ3.82(1H，m，H－11)的信号。13C－NMR中显示内酰胺(δ169.4)和喹诺里西啶环上的碳信号。上述数据与文献［9］报道一致，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为苦参碱(matrine)。

化合物6:白色针状结晶(石油醚)，mp 54～56℃。Dragendorff’sreagent反应显阳性。UV(MeOH):206 nm，258 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等数据与文献报道［9］一致，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为槐果碱(sophocarpine)。

化合物7:白色无定形粉末，mp 240～241℃。Dragendorff’s reagent反应显阳性。EI－MS m/z:399，397(M+)，362(M+－Cl)，334，209(基峰);m/z 399峰高约为m/z 397峰高的1/3，说明该化合物中可能含有氯原子。1H－NMR(DMSO－d6)中:δ6.15(1H，d，J=6.0)为1位羟基质子信号;δ5.42(1H，s)为3位烯氢的信号峰;δ4.58(1H，d，J=6.0 Hz，H－1)，δ 4.48(1H，dd，J=12.0，7.0 Hz，H－10);δ3.99(3H，s)，δ3.86(3H，s)和 δ3.55(3H，s)分别为 19－、18－、17－位－OCH3中氢的信号峰，δ2.27(3H，s)为－NCH3中质子信号峰。13C－NMR(DMSO－d6)中显示 19 个碳原子信号，分别为:200.7(C－4)，192.2(C－6)，188.7(C－2)，159.6(C－8)，138.0(C－7)，105.0(C－3)，72.0(C－13)，69.5(C－1)，67.3(C－11)，60.4(C－19)，59.9(C－18)，59.1(C－17)，57.0(C－10)，52.5(C－12)，51.2(C－15)，45.9(C－5)，40.6(C－9)，37.7(C－14)，36.2(C－16)。上述数据与文献［10－11］数据一致，因此鉴定为尖防己碱(acutumine)。

表2 化合物3和4的13C-NMR数据

化合物8:白色针状结晶(甲醇)，mp 160～162℃。Dragendorff’sreagent反应显阳性。UV(MeOH):214 nm，262 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等数据与文献报道［12］一致，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为青藤碱(sinomenine)。

化合物9:白色棱状结晶(丙酮)，mp 202～204℃。Dragendorff’sreagent反应显阳性。UV(MeOH):216 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等数据与文献［9］报道一致，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为氧化苦参碱(oxymatrine)。

化合物10:白色片状结晶(丙酮)，mp 205～207℃。Dragendorff’sreagent反应显阳性。UV(MeOH):206 nm，255 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等数据与文献报道［9］一致，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为氧化槐果碱(oxysophocarpine)。

化合物11:白色细针状晶体(甲醇)，mp 237～239 ℃，Dragendorff’s reagent反应显阳性。EI－MS m/z:385，383(M+)，348(M+－Cl)，320，295(基峰);m/z 385峰高约为m/z 383峰高的1/3，说明该化合物中可能含有氯原子。其质谱裂解规律与化合物7(尖防己碱)相似，各碎片峰的质量数与尖防己碱相比，都减去14(－CH2－)。该化合物核磁共振的光谱特征与化合物7(尖防己碱)也相似，只是少了－NCH3信号峰。上述数据与文献［14］数据一致，因此鉴定为 N－去甲尖防己碱，即尖防己定碱(acutumidine)。

化合物12:白色无定形粉末，mp 286～288℃，Liebermann－Burchard反应阳性，Molish反应阳性。EI－MS m/z:414(M+－glc)，396(M+－glc－H2O)。核磁数据与β－谷甾醇相对照，除糖上的碳氢信号外，具有高度的相似性。上述数据与文献［13］一致，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为胡萝卜苷(daucosterol)。

化合物13:白色针状结晶(甲醇)，mp 142～144℃，Molish 反应阳性。EI－MS m/z:284(M+－glc)。1HNMR(DMSO－d6)δ:7.36(1H，d，J=8.5 Hz，H－1)，6.98(1H，s，H－7)，6.70(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H－2)，6.55(1H，d，J=2.0Hz，H－4)，6.52(1H，s，H－10)，5.95、5.91(each 1H，s，－OCH2O－)，5.57(1H，d，J=8.5 Hz，H－11a)，4.84(1H，d，J=7.5 Hz，H－1′)，4.27(1H，dd，J=10.75，4.5 Hz，H－6eq)，3.68(1H，m，H－6a)，3.45(1H，m，H－6ax)，3.13 ～5.58 为糖上质子信号。13C－NMR(DMSO－d6)δ:158.6(C－3)，156.3(C－4a)，153.8(C－10a)，147.6(C－9)，141.6(C－8)，131.9(C－1)，118.4(C－6b)，114.3(C－11b)，110.5(C－2)，105.5(C－7)，104.2(C－4)，101.2(－OCH2O－)，100.5(C－1′)，93.4(C－10)，77.8(C－11a)，77.2(C－5′)，76.7(C－3′)，73.3(C－2′)，69.8(C－4′)，66.0(C－6)，60.8(C－6′)，40.2(C－6a)。上述数据与文献［14］报道一致，故确定为高丽槐素－7－O－β－D－葡萄糖苷，即三叶豆紫檀苷(triforlirhizin)。

化合物14:黄色针状结晶(甲醇)，mp 198～200℃。Dragendorff’sreagent反应显阳性。UV(MeOH):266 nm，348 nm。EI－MS m/z:352(M+)。其1H－NMR、13C－NMR 等数据与文献［15］报道一致，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为巴马汀(palmatine)。

化合物15:黄色针状结晶(甲醇)，mp 183～185℃。Dragendorff’s reagent反应显阳性。UV(MeOH):266 nm，350 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等数据与文献［16］基本一致，经与对照品对照，混合熔点不下降，其薄层结果一致，故确定为小檗碱(berberine)。

化合物16:白色无定形粉末，mp 183～184℃。Molish 反应呈阳性。EI－MS m/z:210(M+－glc)。1HNMR(CD3OD)δ:6.74(2H，s，H－2，H－6)，6.54(1H，d，J=16.0 Hz，H－7)，6.32(1H，dt，J=16.0，5.5 Hz，H－8)，4.86(1H，d，J=7.5 Hz，H－1′)，4.21(2H，dd，J=5.5，1.5 Hz，H－9)，3.85(6H，s，3－OCH3，5－OCH3)，3.40(2H，m，6′－CH2)，3.18 ～ 3.82(4H，m，糖上的－CH)。13C－NMR(CD3OD)δ:154.9(C－3，C－5)，136.4(C－4)，135.8(C－1)，131.8(C－7)，130.6(C－8)，106.0(C－2，C－6)，105.9(C－1′)，78.9(C－5′)，78.4(C－3′)，76.3(C－2′)，71.9(C－4′)，64.1(C－9)，63.1(C－6′)，57.5(2 × OCH3)。以上数据与文献［17］报道一致，故确定为丁香苷(syringin)。

化合物17:白色针状结晶(甲醇)，mp 257～259℃;Molish反应阳性。EI－MS m/z:418(M+－2 ×glc)。1H－NMR(DMSO－d6)δ:6.66(4H，s，H－2′，H－6′，H－2″，H－6″)，4.92(4H，dd，J=6.5，4.0 Hz，4 × glc－OH)，4.88(4H，d，J=5.0 Hz，H－glc－1，H－glc－1′，2 ×glc－OH)，4.67(2H，d，J=3.5 Hz，2，6－H)，4.26(2H，t，J=5.5 Hz，glc－6－OH，glc－6′－OH)，4.20(2H，dd，J=9.5，6.5 Hz，H－4e，H－8e)，3.83(2H，dd，J=9.5，3.0 Hz，H－4a，H－8a)，3.76(12H，s，3′－OCH3，5′－OCH3，3″－OCH3，5″－OCH3)，3.60(2H，dd，J=9.5，5.5 Hz，H－glc－6e，H－glc－6′e)，3.41(2H，dd，J=11.25，5.5 Hz，H－glc－6a，H－glc－6′a)，3.01 ～ 3.20(8H，m，H－glc－2 ～ 5，H－glc－2′～5′)，3.10(2H，m，H－1，H－5)。13C－NMR(DMSO－d6)δ:152.8(C－3′，C－5′，C－3″，C－5″)，137.3(C－1′，C－1″)，134.0(C－4′，C－4″)，104.5(C2′，C－6′，C－2″，C－6″)，102.9(C－glc－1，C－glc－1′)，85.2(C－2，C－6)，77.4(C－glc－5，C－glc－5′)，76.7(C－glc－3，C－glc－3′)，74.3(C－glc2，C－glc－2′)，71.5(C－4，C－8)，70.1(C－glc－4，C－glc－4′)，61.1(C－glc－6，C－glc－6′)，56.6(3′－OCH3，5′－OCH3，3″－OCH3，5″－OCH3)，53.8(C－1，C－5)。以上数据与文献［18］报道一致，故确定为丁香脂素－4，4′－O－双－β－D－葡萄糖苷。

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