苜蓿提取物抗炎镇痛作用的实验研究

李兰芳 李存满 张勤增 郝娜 解丽君 李国风

紫苜蓿为多年生草本豆科苜蓿属植物,是我国种植面积最广,营养价值最全面的牧草。民间用全草治疗痢疾、黄疸、尿酸性膀胱结石、尿路结石和浮肿等[1]。苜蓿多糖具有增强免疫和抗肿瘤作用[2]。近年国内、外学者研究了苜蓿皂苷降低实验性高胆固醇血症,并在几种动物得到证实[3,4]。本文研究紫苜蓿提取物对实验动物抗炎、镇痛方面的药理作用,为紫苜蓿的进一步深开发提供了一定的实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 SD大鼠和昆明种小鼠.购于河北省实验动物中心,动物许可证号：SCXK(冀)2003-1-003合格证编号分别为：DK0412-0078,604076,DK0502-0067,604107,604075。

1.2 实验药品与仪器 紫苜蓿,采自河北沧州黄骅苜蓿基地,经河北省药检所鉴定为紫苜蓿全草,紫苜蓿干品,加 10倍量水,浸泡 2h,煎煮 2次,45 min/次,合并两次煎煮液并浓缩至适量,加乙醇至含醇量达 70%,4℃冷藏过夜,过滤,滤液回收乙醇,并浓缩至 1 g生药/m l的浓度,作为实验用样品溶液;角叉菜胶(Carrageean),Sigma公司生产;阿司匹林片,25mg/片,石家庄神威药业股份有限公司生产(批号：20020710)醋酸泼尼松,山东新华制药厂(批号：2000902)DT2000电子天平,常熟市双杰测试仪器厂;JA 2003电子分析天平,上海精密科学仪器有限公司;TDL-5-A型离心机,上海安亭科学仪器厂。

2 方法与结果

2.1 对二甲苯引起的小鼠耳肿胀的影响[5]健康昆明科小鼠50只,体重(20±2)g,随机分为 5组,即模型组、阳性药组(醋酸泼尼松,12mg/kg)、紫苜蓿提取物 3个剂量组(40.0、20.0、10.0 g生药/kg),每组 10只,5组均灌胃给药,连续 3 d,给药体积为 20m l/kg。末次给药后30min,将二甲苯滴于小鼠右耳,15min处死动物,用 6mm打孔器沿左、右耳廓相同部位打孔,两侧耳片分别称重,以两耳片重量差值作为肿胀程度指标,求出抑制率,比较各组差异。见表 1。紫苜蓿提取物 40.0、20.0、10 g生药/kg连续给药 3 d,对二甲苯引起的小鼠耳肿胀有明显的抑制作用(P＜0.05或 ＜0.01)。高、中剂量组对小鼠耳肿胀的抑制率同醋酸泼尼松相当。

表 1 紫苜蓿提取物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 n=10

2.2 对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响[5]取健康SD大鼠50只,雄性,随机分为 5组,即空白对照组(0.9%氯化钠溶液)、阳性药组(阿司匹林 24mg/kg)、苜蓿提取物 3个剂量组(30.0、15.0、7.5 g生药/kg)。 5组均灌胃给药 5 d,于最后 1 d给药后 1 h,于大鼠右后足趾皮下注入 1%角叉菜胶 0.1m l/只,致炎后 1、2、4、6h分别测定足趾厚度,计算肿胀率,分别比较各时间点给药组与模型组之间的差异。结果见表 2。苜蓿提取物高、中、低剂量组从致炎后第 4小时开始有明显的抑制作用,持续到 6 h时抑制作用更为明显,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05或 ＜0.01),抑制作用强度同阿司匹林组相当。

表2 紫苜蓿提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响n=10,±s

表2 紫苜蓿提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响n=10,±s

注：与模型组比较,＊P＜0.05,#P＜0.01

组别 剂量(g生药 /kg)致炎后不同时间肿胀率(%)1h 2 h 4 h 6 h模型组 - 38±9 61±21 71±25 68±24高剂量组 30.0 36±10 46±12 43±20＊ 36±17#中剂量组 15.0 44±10 48±10 49±15＊ 43±13#低剂量组 7.5 41±13 48±16 50±13＊ 45±17＊阿司匹林组 24mg/kg 42±8 50±11 52±9＊ 42±10#

2.3 对大鼠棉球肉芽肿增生模型的影响 选用 SD大鼠 50只,雌雄各半,体重(150±20)g乙醚麻醉,背位固定,下腹部去毛,常规皮肤消毒。下腹部切口,以血管钳向左右两侧蹊部扩充皮下组织,将已称重并灭菌干燥的 30mg棉球植入皮下,缝合伤口。于术后当天,将动物随机分为 5组,每组 10只,分别为紫苜蓿提取物 3个剂量组(30.0、15.0、7.5 g生药/kg),阳性对照药给予醋酸泼尼松(8mg/kg)和模型组。5组均灌胃给药,灌胃容积均为 2.0ml/100g,模型组给予蒸馏水,1次/d,连续 7 d。于第 8天脱臼处死动物,取出棉球,精称湿重,于 60℃烤箱干燥12 h,精称干重,减去原棉球重量即为肉芽肿净重(mg)。与模型组比较,醋酸泼尼松(25mg/kg)效果显著(P＜0.01);紫苜蓿提取物高、中剂量组(30.0、15.0 g生药/kg),对大鼠棉球肉芽肿增生均有明显抑制作用(P＜0.01)。见表 3。

2.4 对醋酸所致小鼠疼痛反应的影响 选用健康昆明种小鼠50只,雌雄各半体重(18±2)g,随机分为 5组,模型组、阳性药组(阿司匹林片,30mg/kg),紫苜蓿提取物 3个剂量组(40、20、10 g生药/kg。各组均灌胃给药,连续 5 d,给药体积为20ml/kg。末次给药后 1 h,腹腔注射 0.6%醋酸溶液,0.2m l/只。观察记录各组小鼠 30m in内扭体次数,比较各组动物扭体次数差异。见表 4。与模型组比较,紫苜蓿提取物 40、20、10 g生药/kg连续给药 5 d,可明显减少醋酸引起的小鼠疼痛模型的扭体次数(P＜0.01)。作用强度与阳性药阿司匹林相当。

表3 苜蓿提取物对大鼠棉球肉芽肿增生的影响n=10,±s

表3 苜蓿提取物对大鼠棉球肉芽肿增生的影响n=10,±s

注：与模型组比较,＊P＜0.01

组别 剂量(g生药/kg)肉芽肿湿重(mg, ±s)肉芽肿干重(mg,±s)抑制率(%)模型组 - 420±43 57±10 -醋酸泼尼松组 10mg/kg 340±38＊ 30±7＊ 47.52高剂量组 30.0 368±39＊ 39±10＊ 32.26中剂量组 15.0 366±40＊ 45±10＊ 20.80低剂量组 7.5 394±51 49±16 14.04

2.5 对热水缩尾法疼痛模型的影响[5]取健康昆明种小鼠,雌雄兼用,体重(18±2)g,将小鼠尾尖端 3 cm浸入 50℃恒温水浴锅中,记录其缩尾的潜伏期为痛阈指标,测两次(间隔10min),求其平均值,取潜伏期是 5～30 s的为合格鼠,剔除过敏(＜5 s)或反应迟钝(＞30 s)的个体。24h后进行实验,取合格小鼠 50只,随机分为 5组,即苜蓿提取物 3个剂量组(40、20、10 g生药/kg),阳性药组(阿司匹林 30mg/kg)和空白对照组,每组 10只。5组动物均灌胃给药 3 d,空白对照组给予蒸馏水。末次给药后 30min,将小鼠尾尖端 3 cm浸入 50℃的恒温水浴锅中,测定各组小鼠的缩尾潜伏期,以小鼠尾回缩出水面的潜伏期作为测痛指标。苜蓿提取物高、中剂量组能提高热水缩尾实验中小鼠缩尾的痛阈,使缩尾潜伏期延长,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或 ＜0.01)。见表5。

表4 苜蓿提取物对醋酸所致小鼠疼痛模型的影响 n=10

表 5 苜蓿提取物对热水所致的小鼠缩尾潜伏期的影响 n=10

3 讨论

炎症的临床特征为红、肿、热、痛,是致炎因子刺激具有血管系统的活体组织对局部损伤的反应。在炎症早期,血管受到刺激,血管内皮间隙扩大,血管壁通透性增强,白细胞和蛋白质等渗出到组织间隙,造成组织肿胀。因此,肿胀是炎症早期的重要指标。在炎症晚期和慢性炎症期,由于内皮细胞、纤维母细胞和实质细胞等增生,形成肉芽组织增生。

本文采用炎症肿胀模型观察了苜蓿水煎液用 70%乙醇沉淀后的提取物对二甲苯引起小鼠耳肿胀和角叉菜胶对大鼠足趾肿胀的影响,在本实验剂量下,苜蓿提取物能对炎症早期的组织肿胀有显著的抑制作用。采用在大鼠皮下埋植棉球的方法,观察到苜蓿提取物对炎症的增殖期肉芽肿形成有显著的抑制作用。提示苜蓿提取物既能抑制炎症早期的水肿和渗出,又可抑制炎症晚期的组织增生和肉芽组织的形成,显示了很好的抗炎作用。

疼痛是由于痛觉感受器受到刺激而产生兴奋,冲动经传入神经纤维到达大脑某些神经细胞,或中枢通路的某一水平受损时所产生的一种不舒适的感觉。引起疼痛的原因众多,本文采用化学刺激致痛法观察到,苜蓿提取物对醋酸引起的疼痛有显著的抑制作用。对热刺激引起的疼痛也有较明显的延长反应潜伏期的作用。

前期研究有关于苜蓿可以协同 PrCl3镇痛作用的报道[6],有关苜蓿单独使用在抗炎、镇痛方面尚未见相关报道。苜蓿化学成分复杂,现已确定皂苷类、黄酮类、蛋白、多糖等,活性研究集中在营养、调节血脂等。但在本研究采用抗炎和镇痛模型证实了苜蓿提取物有很好的抗炎痛作用。并且发挥药效时间短,作用持续时间长,存在一定的剂量效应。

但本实验对苜蓿提取物的抗炎、镇痛作用只是进行了初步的研究。提取方法采用水煎醇沉的传统方法,其中的成分比较复杂,动物的服用剂量较高,在以后的工作中拟对苜蓿提取物有效部位和化学成分进行进一步分离和纯化和鉴定,确定苜蓿抗炎、镇痛的有效成分,进一步探讨其抗炎、镇痛机制及其在体内的代谢规律,为苜蓿的进一步开发和临床应用提供更多的实验依据。

1 宋立人,洪恂,丁旭亮,等主编.现代中药学大辞典(上册).第 1版.北京：人民卫生出版社,2001.1237.

2 赵武迷,张玉琴,任丽娟,等,苜蓿多糖的免疫增强效应.中国药理学报,1993,14：273-276.

3 Malinow MR,Mc laughlin P,Stafford C,etal.Alfalfasaponinsand alfalfasccds dietary effects in cholesterol-fed rabbits.Atherosclerosis,1978,30：27.

4 丛学滋,秦孟根,李子行,等.苜蓿皂甙的降血胆固醇及减轻实验性动脉粥样硬化形成的作用.中国药理学通报,1988,4：293-296.

5 徐叔云主编.药理实验方法学.第 3版.北京：人民卫生出版社,2002.882-888,911.

6 杨蔚,王绍.PrCl3与苜蓿皂甙的协同镇痛作用.白求恩医科大学学报,1995,21：571-573.