茜素黄与牛血清白蛋白相互作用特征的荧光光谱法研究

颜承农 (长江大学化学与环境工程学院,湖北荆州434023;长江大学工程技术学院,湖北荆州434020)

刘 晶 (中原油田采油工程技术研究院,河南濮阳457001)

刘 义 (武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉430072)

蛋白质是生命的最基本物质之一,它与营养、发育、遗传、新陈代谢等生命活动等密切相关,血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白,它能和许多内源性和外源性物质广泛结合。许多药物、农药和染色剂等有机小分子都能和蛋白质等生物大分子发生相互作用。研究它们与蛋白质等生物大分子相互作用特征,探讨相互作用的热力学性质、结合力性质等,可以从分子水平的角度认识蛋白质与小分子相互作用的机理,这对于促进小分子的生物学效应、药理学和毒理学的研究,以及蛋白质组学和生命科学研究等有着重要的意义[1,2]。有机小分子染料可以与蛋白质结合,引起染料或蛋白质光谱特性的变化,因此小分子染料作为测定蛋白质的探针得到了广泛应用,但它们相互作用的机理尚在研究探讨之中。茜素黄 (Alizarin Yellow R,AYR)是一种稳定性比较好的有机染料,可以作为研究有机小分子与蛋白质相互作用的热力学特征及其对蛋白质构象影响荧光的探针。下面,笔者扫描了AYR和AYR作用于牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)的荧光猝灭光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱和紫外-可见吸收光谱,分别用Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程等处理试验数据,得到了相互作用常数和热力学参数等,为研究AYR的染色机理,探讨释放到环境中的AYR产生的生物学效应和对蛋白质构象的影响等提供重要信息。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1)仪器 LS-55型荧光分光光度计 (美国PE公司);TU-1901型紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司);AY120电子天平 (日本岛津公司);恒温水浴SYC-15型 (南京桑力电子设备厂)。

2)试剂 AYR储备液,200μ g/mL;AYR工作液,12μ g/mL;BSA(上海生物化学制剂厂)溶液,5.0×10-5mol/L;NaCl溶液,0.5mol/L;Tris-HCl缓冲溶液,pH=7.40。所用试剂均为分析纯,水为二次去离子水,经检测均无荧光杂质。

1.2 试验方法

在10ml比色管中依次加入 2.0ml的NaCl(0.5mol/L)溶液、2.0ml的 Tris-HCL缓冲溶液(pH=7.40)和2.0ml的BSA(5.0×10-5mol/L)溶液及0～3.5ml的AYR溶液,以二次去离子水定容;当激发光波长为285nm、狭缝宽度分别为15nm和2.5nm时,常压下,分别于21、26、31、36、41℃时,在250～500nm范围内扫描了BSA的荧光猝灭光谱,同时在26℃时测定了体系的同步荧光光谱、三维荧光光谱和紫外-可见吸收光谱,分别获得试验对象的相对荧光强度和吸光度等。

2 AYR对BSA的荧光猝灭光谱

2.1 荧光猝灭光谱

BSA分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基能够发射内源荧光,当激发光波长为285nm时,BSA荧光发射峰位置在347nm附近。按试验方法分别扫描了21、26、31、36、41℃等温度下BSA的荧光发射光谱和BSA-AYR体系的荧光猝灭光谱,26℃的BSA和BSA-AYR体系的荧光猝灭光谱见图1。由图1可以看出,随着AYR浓度增加,BSA的荧光发射峰强度有规律地降低,表明AYR分子能够与BSA发生相互作用进而猝灭BSA的内源性荧光。

图1 BSA和BSA-AYR体系荧光猝灭光谱

2.2 荧光猝灭作用描述

有机小分子对蛋白质的荧光猝灭作用可分为动态猝灭、静态猝灭和非辐射能量转移猝灭等。动态猝灭主要是一种能量转移或电子转移过程,不影响蛋白质的结构和生理活性,而静态猝灭主要是由于小分子和蛋白质等生物大分子发生了相互作用,可能生成不发荧光的配合物,影响了蛋白质的二级结构,导致蛋白质生理活性发生变化。

动态猝灭和静态猝灭作用可分别用Stern-Volmer方程:

和Lineweaver-Burk方程:

进行描述。式中,IF为有猝灭剂时BSA的荧光强度;为无猝灭剂时BSA的荧光强度;cAYR为猝灭剂浓度;KSV为动态猝灭常数,它反映了生物大分子与荧光猝灭剂分子彼此扩散和相互碰撞到达动态平衡时的量效关系;Kq为动态荧光猝灭速率常数,它反映了体系中分子的彼此扩散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率的影响,各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010L/(mol·s);τ0为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命,生物大分子的荧光平均寿命约为10-8s;KLB为静态荧光猝灭结合常数,单位是mol/L,它反映了在静态猝灭过程中生物大分子与荧光猝灭剂分子相互作用达到平衡时的量效关系[3,4]。

3 荧光猝灭作用性质和相互作用力

3.1 荧光猝灭作用性质

在温度分别为 21、26、31、36、41℃时,由试验数据分别作出 BSA的Stern-Volmer曲线和Lineweaver-Burk双倒数曲线,如图2所示。对数据线性拟合得到直线方程、相关系数R等见表1。

图2 Stern-Volmer曲线和Lineweaver-Burk曲线

表1 线性回归方程和相关系数

表2 AYR对BSA作用常量和热力学参数

由AYR对BSA作用的试验结果可以看出,Lineweaver-Burk双倒数曲线的线性关系明显优于Stern-Volmer曲线的线性关系;动态猝灭作用的Kq值一般都小于2.0×1010L/(mol·s),但表2中Kq值大于2.0×1010L/(mol·s);相互作用的吉布斯自由能 Δ G小于零,相互作用常量 KLB达到4.394×104mol/L,说明它们之间的相互作用能自发进行,且作用产物稳定性良好。BSA、AYR和BSA-AYR体系的紫外-可见吸收光谱如图3所示。在图3中,BSA、AYR和BSA-AYR体系的紫外-可见吸收光谱的吸收峰强度和吸收峰位置明显有别。按照试验方法分别得到 Δλ=60nm 和 Δ λ=15nm 时,BSA和 BSA 与AYR作用的同步荧光光谱,如图4(a)和4(b)所示 。在 Δλ=60nm和 Δ λ=15nm时的同步荧光光谱主要分别反映蛋白质中Trp和Tyr氨基酸残基的荧光光谱特征[5]。随着 AYR浓度的增加,相对BSA的荧光发射峰而言,T rp的发射波长红移0.85nm,Tyr的发射波长蓝移2.0nm。这些都是BSA与AYR相互作用生成一种新复合物的佐证。

图3 AYR(1)、BSA(2)和AYR-BSA体系的BSA紫外-可见吸收光谱(3～6)

3.2 相互作用力

有机小分子与蛋白质相互作用的主要部位是蛋白质上的精氨酸、赖氨酸、组氨酸和N端氨基等碱性氨基酸残基。相互作用力有氢键作用力、静电作用力、疏水作用和范德华力等。Ross等[6]总结了判断生物大分子与有机小分子等作用力性质的热力学规律,即疏水作用力可使体系的ΔH(等压热效应)和ΔS(熵变化)增大,氢键力或 Vander Waals力有可能使体系的 ΔH和ΔS减小,静电作用力使ΔH ≈0,Δ S＞0。

图4 同步荧光光谱

当温度变化范围不太大时,反应的焓变ΔH可以看作是一个常数。由Van't Hoff等压方程的不定积分式:

作图可以求得ΔH(见图5),由方程:

可求 Δ Gθ和ΔS等,见表2。相互作用的ΔH ≈0,ΔS＞0,说明AYR与BSA之间的作用力可能主要是静电作用力。这可能是在试验条件下,BSA上的正电性氨基 (—NH3+)把带负电荷的茜素黄分子吸引到了蛋白质空间结构的表面,同时由于氢键等其他非静电力使两者结合的更加紧密。

图5 ln KLBθ～1/T图

4 AYR与BSA相互作用的表观作用常数KA和作用位点数n

设生物大分子B有2个相同且独立的结合位点,与猝灭剂(Q)间的结合常数为KA,它们与荧光强度之间符合以下关系式:

式中,KA为表观作用常数,斜率为作用位点数n。作图,由直线截距可求表观作用常数平均值为5.930×105,由斜率可求作用位点数平均值为1.183。表明BSA与AYR分子可能是1对1相互结合为复合物。

5 AYR对BSA构象的影响

研究证明,三维荧光光谱能提供更多被研究对象的相关信息[7]。蛋白质中氨基酸残基的最大荧光发射波长与外界分子的作用和它们所处环境的极性等因素有关。BSA在AYR作用前后的荧光猝灭光谱、同步荧光光谱和三维荧光光谱的峰强度和峰波长均有明显变化。BSA的空间结构由3个结构域组成,每个结构域由2个亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒状结构,几乎所有的疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部,构成疏水腔。在水溶液中,BSA主要由疏水作用力维持其空间结构和疏水腔。按照试验方法扫描了BSA和AYR-BSA体系的三维荧光光谱 (见图6),绘制了等荧光强度图 (见图7)。由图6、图7可比较AYR作用BSA前后三维荧光光谱的变化,探讨AYR对BSA构象和微环境的影响。AYR作用BSA后,在荧光发射光谱中BSA的Trp的峰位有明显红移,其对应的同步荧光光谱证实红移现象(见图4(a))。而Tyr峰位红移现象 (见图4(b))在图1中是被掩盖了的。在图6(a)中,当BSA的浓度为1.0×10-5mol/L时,其荧光峰峰顶的相对荧光强度和峰顶坐标(IF,λex/λem)为 (492.1,280.0nm/348.5nm),与二维荧光发射光谱图一样,主要描述T rp和Tyr的荧光光谱行为。在图6(b)中,当加入AYR后,BSA的峰顶的相对荧光强度和峰顶坐标(IF,λex/λem)为 (283.2,280.0nm/346.0nm),荧光强度降低了208.9,激发波长未移动,但发射波长蓝移了2.5 nm,说明AYR与BSA作用后,部分能量转移到了AYR上,同时显示Trp所处微环境的极性有所削弱,它们尽可能分布在BSA腔内的疏水区内,而Tyr所处微环境的极性有所增强,可能分布在BSA分子表面附近的亲水区内,导致BSA形成了一种新的无序结构。

图6 BSA和BSA-AYR体系的三维荧光光谱

6 结 论

1)由21～41℃温度范围内体系的荧光猝灭光谱数据,得到了AYR和BSA相互作用的荧光猝灭结合常数KLB的平均值为4.394×104mol/L,热力学参数ΔHθ、Δ Gθ和Δ Sθ的平均值分别为-3.408kJ/mol、-27.02kJ/mol和77.64J/K,结合位点数的平均值为1.183;荧光猝灭性质主要是静态猝灭,相互作用力主要是静电作用力。蛋白质分子中的疏水效应、各基团之间的氢键作用和静电作用力是稳定和维持其二、三级结构的重要因素。

2)由同步荧光光谱和三维荧光光谱的特征可以看出,AYR作用BSA后,BSA所处微环境的极性发生了明显变化,加上静电力的作用,肽链紧密度增加;非极性的Trp可能更加倾向于分布在BSA分子的疏水部位,而极性的Tyr则更倾向于分布在AYR亲水区内,这就导致了BSA原有的有序结构破坏,形成了一种新的无序结构。

图7 BSA和BSA-AYR体系的等荧光强度图

3)从所得结合常数看,与BSA的结合常数达到104数量级,且能改变蛋白质的构象,说明AYR也可在哺乳动物等生物体内运载、贮存和积蓄,这也是AYR对生态环境一定负面效应的有力证明[8,9]。

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