高钼低铜对小鼠肾脏结构及其表达TNF-α蛋白的影响*

王宏伟,周变华,张 樑,张 森,胡文发,杨自军

(河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471003)

高钼低铜对小鼠肾脏结构及其表达TNF-α蛋白的影响*

王宏伟,周变华,张 樑,张 森,胡文发,杨自军

(河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471003)

为研究高钼低铜对小鼠肾脏结构及TNF-α蛋白表达的影响,选用80只雄性昆明种小鼠随机分为4组,在饮水中添加不同浓度的钼(600 mg/L)及铜(3mg/L),建立动物模型。在试验处理第90天时采样,研究高钼低铜对小鼠肾脏组织病理学及TNF-α表达的影响。结果显示,高钼组小鼠肾脏组织肾小体聚集,部分肾小球发生萎缩,间质中有大量炎性细胞浸润,有新月体出现。与对照组相比,高钼组肾脏TNF-α蛋白表达量上升15.60%(P＜0.01);与低铜组相比,高钼低铜组肾脏TNF-α蛋白表达量上升24.60%(P＜0.01);与高钼组相比,高钼低铜组肾脏TNF-α蛋白表达量上升7.14%(P＜0.05)。表明高剂量钼导致肾脏发生明显的病理组织学损伤,显著提高了小鼠肾脏TNF-α的表达,低铜加剧了钼的毒性作用。

钼 ;铜;小鼠 ;肾脏 ;TNF-α

近年来,随着钼矿业的快速发展及钼作为饲料添加剂被广泛应用于动物生产,钼对人畜健康的影响也日益明显。经调查证实,我国河南、陕西、山西、甘肃、江西等省钼矿附近均存在不同程度的污染,尤其豫西地区钼储量极大,居亚洲第一位,世界第三位,矿区周围环境中钼含量,远远高于其他地区。这就为动物通过采食、饮水等途径引发钼中毒提供了物质基础,是动物健康的严重潜在威胁[1-2]。

研究表明,钼和铜之间在代谢上有明显的颉颃作用。日粮中钼含量过高,会使铜的利用率下降,导致机体继发性铜缺乏[2-3]。也有观点认为钼和铜之间又有协同作用,适量的铜是机体吸收钼所必需的。本研究通过建立高钼低铜小鼠动物模型,研究高钼低铜对小鼠肾脏组织病理学损伤及 TNF-α蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 80只21日龄健康雄性昆明种小鼠,购自于郑州大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 钼酸钠(Na2MoO4◦2H2O)为天津市化学试剂四厂产品;硫酸铜(CuSO4◦5H2O)为北京化工厂产品;苏木素为上海楷洋生物技术有限公司产品;伊红为上海楷洋生物技术有限公司产品;SABC免疫组化试剂盒为武汉博士德生物有限公司产品;DBA显色试剂盒为武汉博士德生物有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 选取80只雄性昆明种小鼠,随机分为4组,在饲喂低钼低铜饲料基础上,通过在饮水中添加钼与铜建立试验动物模型(表1)。

表1 试验设计Table 1 Expe rimental design

1.2.2 样品的采集与制片 在试验第90天,每组随机取6只小鼠,迅速取左侧肾脏组织后,放入40 mL/L多聚甲醛中固定 24 h。然后放入700 mL/L酒精中,酒精梯度脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋。

1.2.3 小鼠肾脏组织切片的制备及免疫组化实验利用苏木精-伊红染色技术对小鼠肾脏组织形态学进行观察。并利用SABC免疫组化试剂盒和DBA显色试剂盒,对小鼠肾脏 TNF-α蛋白表达进行观察。采用Image-Proplus v.5.1图像分析软件(美国MC公司)处理数据,对 TNF-α的表达进行光密度值相关分析,结果采用平均值±标准差表示。

1.2.4 数据处理 SAS 9.0软件对所得数据进行t检验处理,以P＜0.05和P＜0.01作为差异显著性判定标准。测定结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示。

2 结果

2.1 高钼低铜对小鼠肾脏组织形态学的影响

对照组肾脏组织细胞结构比较清晰,肾小管上皮细胞结构正常(图1A)。

低铜组部分肾小管中出现透明管型;肾小体体积增大,细胞数量增多;肾小囊腔狭窄呈裂隙状;肾间质可见少量的淋巴细胞浸润(图1B和图1C)。

高钼组肾小体聚集;部分肾小球萎缩;肾间质可见大量的炎性细胞浸润;肾小管腔内出现蛋白管型和细胞分解产物聚集形成的颗粒管型;极少数肾小囊内有新月体形成(图1D～图1F)。

高钼低铜组肾脏组织的部分肾小体萎缩;肾小球和肾小囊发生粘连,整个肾小囊腔发生完全或部分闭塞;出现少量纤维性新月体(图1G和图1H)。

图1 小鼠肾脏组织病理组织学观察(400×)Fig.1 Histopathological observation in kidney of mice(400×)

2.2 高钼低铜对小鼠肾脏TNF-α蛋白表达量的影响

TNF-α为胞浆型表达的细胞因子,本试验采用过氧化物酶使底物发生反应,与反应部位产生棕黄色颗粒状产物,依据棕黄色颗粒的多少及染色深浅判定阳性强度。由图2A～图2F可见,对照组肾脏组织肾小管有特异性着色,形成弱阳性着色带;低铜组肾脏组织形成的着色带较对照组颜色浅;高钼组肾脏组织切片中,阳性细胞胞浆可见散在分布的棕黄色颗粒,表达细胞多分布于肾小管部位;高钼低铜组肾脏组织切片中,颜色加深的棕黄色颗粒弥漫性分布于肾小管部位。

与对照组相比,高钼组肾脏TNF-α蛋白表达量显著上升15.60%(P＜0.01);与低铜组相比,高钼低铜组肾脏 TNF-α蛋白表达量显著上升24.60%(P＜0.01);与高钼组相比,高钼低铜组肾脏TNF-α蛋白表达量显著上升7.14%(P＜0.05)(图3)。

图2 小鼠肾脏组织免疫组化观测(400×)Fig.2 Immunohistochemistry observation in kidney of mice(400×)

图3 高钼低铜对小鼠肾脏TNF-α蛋白表达量的影响Fig.3 Effect of high molybdenum low copper on TNF-αexpression of kidney in mice

3 讨论

肾脏是机体新陈代谢过程中所产生的各种代谢终产物和过剩物质的主要排出器官之一。且肾脏产生的尿中所含的排泄物种类最多、量也最大,作为机体最重要的排泄器官,肾脏也是体内药物及毒物代谢和排泄的重要器官。微量元素钼大多数以水溶性(主要是钼酸盐)在消化道内被吸收,作为非反刍动物的小鼠,钼主要在小肠内被吸收。吸收后的钼随血液循环可分布于动物所有组织器官和体液中,其中以骨髓、肾脏及肝脏含量最高。当机体摄入过多钼时,肾脏作为机体对钼代谢的最主要器官将积聚大量的钼,从而引起肾脏发生一系列病理变化,影响机体的各项生理功能,表现出相应的症状。

本试验发现,高剂量钼导致肾脏组织发生明显的组织形态学损伤,这可能是由于动物机体内钼含量增加,导致黄嘌呤氧化酶(XO)活力的升高而在机体内会生成大量的超氧化物如超氧阴离子自由基(O2-),同时XO还可促进NO的大量生成等[4-5],氧自由基又会启动机体的脂质过氧化反应而损伤组织细胞及其大分子物质,这可能是钼中毒的毒性机理之一[6];同时本试验发现,钼摄入过量时,与摄入正常剂量铜的小鼠相比,摄入低剂量的铜的小鼠的肾脏组织形态受到更加严重的损伤。原因之一可能为超氧化物歧化酶(SOD)能有效地清除氧自由基,从而抑制脂质过氧化反应,并能稳定细胞膜。当机体内铜减少时,Cu-SOD活力将显著下降,SOD对氧自由基的清除能力减弱[7]。

细胞因子在一定条件下可加重组织炎症或免疫损伤,且 TNF-α在感染、组织损伤、炎症、休克等方面起重要介导作用[8]。近年来还发现TNF-α在中枢神经系统以及许多生物因子诱导的组织损伤过程中也起重要作用[9]。吴小南等曾在慈菇对镉致急性肝损伤过程中TNF-αmRNA表达的影响中报道,一次大剂量氯化镉的腹腔注射可诱导肝脏组织TNF-α mRNA的表达显著升高[10]。本试验发现,与对照组相比,高钼组肾脏 TNF-α蛋白表达量上升15.60%(P＜0.01);与低铜组相比,高钼低铜组肾脏TNF-α蛋白表达量上升24.60%(P＜0.01),说明过量的钼会导致肾脏组织TNF-α的表达发生极显著的升高。与高钼组相比,高钼低铜组肾脏TNF-α蛋白表达量上升7.14%(P＜0.05),说明高剂量钼作用下,缺铜导致TNF-α的表达量增加,加剧了高剂量钼的毒性作用。

综上所述,高剂量钼可导致小鼠肾脏组织形态严重受损,缺铜后可加剧高剂量钼对小鼠肾脏组织形态的损伤;高剂量钼导致肾脏中TNF-α蛋白表达增强,缺铜后使高剂量钼引起的肾脏TNF-α蛋白表达量增强。

[1]刘凤军,贺加双,杨自军,等.小鼠钼中毒的毒性试验[J].动物医学进展,2009,30(2):56-60.

[2]杨自军,冉林武,王 婷,等.锌、铜对钼中毒绵羊免疫功能的影响[J].中国兽医学报,2009,29(2):207-209.

[3]Shen X,Du G,Li H.Studies of a naturally occurring molybdenum-induced copper deficiency in the yak[J].Vet J,2006,171:352-357.

[4]Silanikovea N,Shapiroa F,Shamaya A,et al.Role of xanthine oxidase,lactoperoxidase,and NO in the innate immune system of mammary secretion during active involution in dairy cows:manipulation with casein hydrolyzates[J].Free Radical Biol M ed,2005,38:1139-1151.

[5]Portugal-Cohen M,Numa R,Yaka R,et al.Cocaine induces oxidative damage to skin via xanthine oxidase and nitric oxide synthase[J].J Dermatol Sci,2010,58:105-112.

[6]李建喜,王学智,杨志强.钼和铜对小鼠抗氧化机能的影响[J].中国兽医科技,2004,34(11):22-25.

[7]Hawk S N,Lanoue L,Keen C L,et al.Copper-deficient rat embryos are characterized by low superoxide dismutase activity and elevated superoxide anions[J].Biol Reprod,2003,68:896-903.

[8]Su B,Wang J,Wang X,et al.T he effects of IL-6 and TN F-α as molecular adjuvants on immune responses to FMDV and maturation of dendritic cells by DNA vaccination[J].Vccine,2008,26:5111-5122.

[9]Tangpong J,Cole M P,Sultana R,et al.Adriamycin-induced,TNF-α-mediated central nervous sy stem toxicity[J].Neurobiol Dis,2006,23:127-139.

[10]吴小南,陆祖福,黄 芳,等.慈菇对镉致急性肝损伤过程中TNF-αmRNA表达的影响[J].中国公共卫生,2002,18(11):1312-1313.

Effect of High Molybdenum Low Copper on the Structure and TNF-αExpression of Kidney in Mice

WANG Hong-wei,ZHOU Bian-hua,ZHANG Liang,ZHANG Sen,HU Wen-fa,YANG Zi-jun

(College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Hehan,471003,China)

To investigate the effect of molybdenum or copper on the structure and TNF-αexpression of kidney in mice,eighty female Kunming mice were randomly divided into 4 groups.Animal models were established by adding molybdenum(600 mg/L)or copper(3 mg/L)into drinking water.On the 90thday,kidneys were collected to be researched.The results are as follows:In the high molybdenum group,the renal corpuscles closed together,some of them appeared adhesion,plenty of inflammatory cells infiltration,and a little of crescent were observed.Compare with the control group,the lever of TNF-αexpression were significantly increased by 15.60%in the HM group(P＜0.01),The lever of TNF-αexpression were significantly increased by 24.60%in the HMLC group(P＜0.01),compared with the control group.Compare with the HM group,the lever of TNF-αexpression increased by 7.14%in the HMLC group(P＜0.05).The results indicated that,excessive molybdenum induced sever damage in the kidney.The level of TNF-αexpression was obviously increased.Deficiency copper aggravated the molybdenum toxic action in kidney.

molybdenum;copper;mice;kidney;TNF-α

S859.8;S852.31

A

1007-5038(2010)09-0051-04

2010-06-25

河南科技大学博士启动基金项目(09001368);河南省教育厅自然科学研究计划项目(2010B230002)

王宏伟(1978-),男,山西朔州人,博士,主要从事动物中毒病研究。