鹅源副黏病毒融合蛋白在毕赤酵母细胞中的表达*

冯 新,宋战昀,刘 阳,张 琼,姜永莉,丁 壮*

(1.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春 130062;2.吉林出入境检验检疫局,吉林长春 130062;3.辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连 116001)

鹅源副黏病毒融合蛋白在毕赤酵母细胞中的表达*

冯 新1,宋战昀2,刘 阳2,张 琼3,姜永莉2,丁 壮1*

(1.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春 130062;2.吉林出入境检验检疫局,吉林长春 130062;3.辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连 116001)

应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出F蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pT-F。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pT-F,回收目的基因F片段,并将其定向克隆到pPICZα A中,构建重组质粒pPICZα A-F。用PmeⅠ酶切 pPICZα A-F使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中。PCR法鉴定阳性重组子,10 mL/L甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果表明,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63 ku的重组蛋白,该重组蛋白可与NA-1株鹅源副黏病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应。

鹅源副黏病毒;F蛋白;毕赤酵母;表达

*通讯作者

鹅源副黏病毒编码两种囊膜糖蛋白,融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN),F蛋白位于囊膜外表面,形成纤突,是重要的保护性抗原,也是决定鹅源副黏病毒致病力强弱的关键因素[1]。F蛋白能使病毒囊膜与宿主细胞融合,完成病毒囊膜与细胞膜的融合,使病毒穿过细胞膜而进入到细胞内进行复制,并介导病毒感染的细胞与相邻细胞之间的融合,导致多核巨细胞或合胞体的产生[2]。随着对鹅源副黏病毒分子生物学研究的不断深入,人们对鹅源副黏病毒基因组结构和功能及其与致病性关系的研究有了较大的进展[3],发现不同致病性的鹅源副黏病毒在分子结构上存在差异。特别是对F蛋白的细胞膜融合功能与致病性关系的探索性研究,使得人们对不同致病性鹅源副黏病毒的结构基础有了较深入的了解[4]。吉林大学畜牧兽医学院重要动物病原与疫病研究室从1999年开始对鹅源副黏病毒进行研究,至今已从多个层面对鹅源副黏病毒与经典的新城疫病毒进行了较为系统的比较研究,其中从抗原性[5]、细胞形态发生学[6]、受体特异性[7]等方面均表明鹅源副黏病毒与经典的新城疫病毒存在差异,而这些差异的重要来源之一是与病毒各自F蛋白的特性密切相关。本研究对鹅源副黏病毒F蛋白进行了酵母表达,为进一步在F蛋白结构与功能、致病的分子基础方面的研究提供试验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 血清Ⅰ型副黏病毒NA-1株为鹅源分离病毒经过空斑法纯化后由吉林大学畜牧兽医学院重要动物病原与疫病研究室保存[8]。

1.1.2 表达载体和菌株 pGEM-T载体为 Promega公司产品;毕赤酵母表达载体pPICZα A、毕赤酵母表达宿主菌GS115以及克隆宿主菌 TOP10、Zeocin药品均为Invitrogen公司产品。

1.1.3 主要试剂 Trizol RNA提取试剂盒、T4 DNA连接酶、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)、限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ、DNA标准DL 15 000、DL 2 000、DNA片段凝胶回收试剂盒等均为宝生物工程(大连)有限公司产品;限制性内切酶PmeⅠ为New England Biolab公司产品;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品;培养基YPD、BMGY、BMMY均为BBI公司试剂;酵母菌基因组DNA快速抽提纯化试剂盒为上海华舜生物工程公司产品;pPICZα A 载体上通用引物5′Pichia primer、3′Pichia primer和 α-Factor sequencing primer的合成和序列测定均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.1.4 NA-1阳性血清 由NA-1株病毒经4次免疫健康家兔而获得,其血凝抑制效价为1∶1 024。

1.2 方法

1.2.1 F基因的PCR扩增与克隆 根据GenBank中NA-1株病毒全基因序列(GenBank号DQ659677.1),设计合成特异性引物,用于F基因片段的扩增。F1:5′-TGAGAATTCATGGGCTCCAAACCTTCTACC-3′;F2:5′-GACGTCGACTCATGCTCTTGTA GTGGCTCT-3′;并在上、下游引物中分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点(下划线部分表示),并各加3个保护性碱基。使用Trizol RNA提取试剂盒提取病毒RNA,PCR扩增F基因,用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。将回收的F基因片段与pGEMT载体16℃连接过夜,并转化大肠埃希菌TOP10;用F基因特异性引物和EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定来筛选阳性重组质粒pT-F并测序。

1.2.2 酵母表达载体pPICZα A-F的构建和鉴定 将鉴定正确的pT-F与pPICZα A用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,分别回收目的片段和载体大片段进行连接,并转化TOP10感受态细胞,用含Zeocin(25 mg/L)的低盐LB平板筛选培养。阳性重组质粒pPICZα A-F的鉴定和筛选方法如下:用EcoRⅠ和NotⅠ进行限制性内切酶双酶切鉴定,用F基因特异性引物、pPICZα A 上通用引物5′Pichia primer和3′Pichia primer以及 pPICZα A 上通用引物 α-Factor sequencing primer和3′Pichia primer进行 PCR 鉴定。

1.2.3 pPICZα A-F的线性化和酵母菌的电击转化用PmeⅠ对阳性重组质粒pPICZα A-F进行线性化,纯化回收线性化片段。取10 μg线性DNA与冰预冷的酵母感受态细胞GS115混匀,转入Bio-RAD 610型1.0 mm电击杯中,用Bio-RAD Gene Pluser电转仪在 375 V/cm 、25 μ F 、250 Ω的条件下进行电击转化。按Invitrogen公司操作手册对酵母重组子进行筛选。提取酵母基因组DNA,用F基因特异性引物进行PCR鉴定,筛选出阳性的GS115整合子用于诱导表达。

1.2.4 酵母重组子的甲醇诱导表达 阳性菌落接种于10 mL BMGY培养基中,28℃～30℃,180 r/min振荡培养至OD600为2.0～6.0,离心收集菌体,用BMMY培养基重悬(OD600≈1.0),在1L培养瓶中,28℃～30℃,180 r/min摇瓶培养7 d,每隔24 h补加 100%甲醇溶液至其终浓度为10 mL/L,每隔24 h取出1 mL样品用于表达产物检测。

1.2.5 表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析 取诱导表达的培养物上清,经10 000 r/min,离心10 min,取上清与等体积的二倍上样缓冲液混匀,100℃煮沸5 min,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达,然后进行Western blot检测,一抗为抗NA-1阳性血清,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。

2 结果

2.1 F基因的扩增与克隆

经琼脂糖凝胶电泳,F基因片段PCR产物与预期的1 662 bp大小相符(图1);回收目的DNA片段,将其克隆到pGEM-T载体中,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切得到3 000 bp、1 662 bp两条片段,与预期大小相符(图2)。

图1 NA-1株病毒F基因RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR amplification of NA-1 F gene

图2 pT-F质粒酶切鉴定结果Fig.2 Identification of recombinant plasmid pT-F by enzyme digestion

2.2 重组质粒pPICZα A-F的鉴定

重组子pPICZα A-F用EcoRⅠ/NotⅠ双酶切,得到3 545 bp和 1 680 bp两条片段;以重组子pPICZα A-F为模板,用 F基因特异性引物F1和F2进行PCR扩增,可得到1 680 bp大小的核酸片段;用 pPICZα A 上通用引物5′Pichia primer和3′Pichia primer进行PCR扩增,可得到2 218 bp大小的核酸片段;用pPICZα A 上通用引物 α-Factor sequencing primer和 3′Pichia primer进行 PCR 扩增,可得到1 929 bp大小的核酸片段;结果与预期大小相符(图3),表明重组质粒pPICZα A-F构建正确。

2.3 重组酵母的筛选与鉴定

电转化酵母感受态细胞GS115,用酵母菌用试剂盒提取基因组DNA,以酵母基因组DNA为模板,用F基因特异性引物进行PCR扩增,得到1 680 bp大小的条带与理论值大小相符的条带,表明重组酵母表达质粒成功的整合到酵母染色体DNA中。经鉴定筛选得到的阳性重组酵母菌3株(图4)。

图3 重组质粒pPICZα A-F的酶切和PCR鉴定结果Fig.3 Identification of recombinant plamid pPICZα A-F by enzyme digestion and PCR

图4 重组酵母菌PCR鉴定结果Fig.4 Identification of recombinant P.pastoris GS115 by PCR

2.4 重组蛋白SDS-PAGE及Western blot检测

3株重组酵母菌经10 mL/L甲醇诱导7 d,每隔24 h取样,离心后取上清,进行SDS-PAGE检测,结果发现诱导24 h后F重组蛋白就有表达,至第7天的重组酵母菌培养基上清中均能检测到相对分子质量为63 ku的目的蛋白,与预期值相符。Western blot分析结果显示,重组酵母菌表达的重组蛋白可与NA-1多克隆抗体发生特异性血清反应(图5)。

3 讨论

自1997年鹅副黏病毒病首先在江苏[9]暴发以来,给我国的养鹅业造成了巨大的经济损失。1999年本研究室[8]在吉林省农安县分离到感染鹅的禽副黏病毒强毒株,经病毒的分离、鉴定,确定其分类地位为副黏病毒科,命名为NA-1株,以嗜内脏速发型和嗜神经速发型为主。本研究室已在流行病学[10]、免疫学[5]、全基因组水平[11]、细胞形态发生学[6]、受体特异性[7]等方面,证实NA-1株鹅源副黏病毒与经典的新城疫病毒F48E9存在较大变异。这些新情况的出现说明禽副黏病毒在我国的流行又出现了新的变化,其致病性和抗原性发生了新的改变。全基因组测序表明,NA-1株病毒F基因全长1 662 bp,编码553个氨基酸,其分子质量约为59 338 u[11]。含有6个糖基化位点,12个半胱氨酸残基,而且这些糖基化位点和半胱氨酸残基的位置与NDV F48E9相同,说明F基因的糖基化位点和半胱氨酸残基是高度保守的。F蛋白有3个强疏水区,第1个疏水区位于1～25个氨基酸残基处,为F蛋白N端信号肽区,第2个疏水区位于117～142氨基酸残基处,为融合诱导区,该区域正好是F1 N端,当F0裂解产生F1和F2后,F1 N端直接参与膜融合,第3个疏水区位于500～522氨基酸残基处,与蛋白的胞质区相邻,为蛋白跨膜区,具有终止蛋白转移和膜锚定功能[12]。

图5 F基因在毕赤酵母GS115中的分泌表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析结果Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of culture broth of F gene expressed in P.pastoris GS115

巴斯德毕赤酵母表达系统是一种近年来广泛使用的真核表达系统,具有大肠埃希菌操作简单、生长速度快、易于高密度发酵且培养成本低的优点,又有真核细胞翻译后修饰加工,能形成正常的二硫键和较为合理的糖基化的特点,使外源蛋白更具有天然的生物学活性。本试验表达产物约为63 ku,F0蛋白由553个氨基酸组成,在哺乳动物细胞中完全糖基化后的分子质量为68 ku,本研究室前期利用昆虫细胞的杆状病毒表达系统也成功的进行了F基因的表达,表达产物的大小也约为63 ku[13],这说明在在两种表达系统中,合成的蛋白都可以糖基化,但均属于不完全糖基化。毕赤酵母对外源蛋白的糖基化修饰也比较合理,不会产生过度糖基化。毕赤酵母表达系统是外源基因通过同源重组整合到宿主菌的染色体上的,因而构建的表达菌株稳定性很高,可稳定培养100代以上,毕赤酵母表达载体具有的信号肽,能将外源蛋白分泌到胞外,而酵母内源蛋白分泌到胞外的组分很少,有利于目的蛋白的纯化。表达产物经Western blot分析证实该表达蛋白具有良好的反应原性。由于F蛋白是副黏病毒感染宿主细胞时发生细胞融合的关键蛋白,因此,该表达产物可为进一步研究病毒与宿主细胞膜发生融合的机制提供基础材料。

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Expression of Fusion Protein of Goose Paramyxovirus inPichia pastoris

FENG Xin1,SONG Zhan-yun2,LIU Yang2,ZHANG Qiong3,JIANG Yong-li2,DING Zhuang1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,J ilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China;
2.J ilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Changchun,J ilin,130062,China;
3.Liaoning Entry-Exit inspection and Quarantine Bureau,Dalian,Liaoning,116001,China)

To express F protein of NA-1 inPichia pastoris,F gene was amplified by RT-PCR from NA-1 with a pair of specific primers.Then PCR product was purified and cloned into pGEM-T vector to obtain the plasmid pT-F.The gene fragment was recovered after the double enzyme digestion withEcoRⅠandNotⅠ ,then was subcloned into pPICZαA.The recombinant pPICZα A-F was linearized withPmeⅠ and then transformed into GS115 yeast cells for expression.The recombinant strains were screened by PCR technique.The expression products were identified by SDS-PAGE and Western blot.The results showed that there was a molecular weight of 63 ku protein specifically recognized by polyclonal antibody against NA-1.It suggested that the F protein of NA-1 was obtained inPichia pastorisexpression system.

Goose paramyxovirus;F protein;Pichia pastoris;expression

S852.659.5

A

1007-5038(2010)09-0007-05

2010-06-08

国家自然科学基金项目(30771606;30901069)

冯 新(1978-),女,内蒙古赤峰人,讲师,博士研究生,主要从事兽医微生物和免疫学研究。