鸡血藤不同极性段提取物制备及体外抑菌作用初步研究*

胡庭俊,何彩美,钟 晶

(广西大学动物科学技术学院,广西南宁 530005)

鸡血藤不同极性段提取物制备及体外抑菌作用初步研究*

胡庭俊,何彩美,钟 晶

(广西大学动物科学技术学院,广西南宁 530005)

采用水、丙酮和乙醇等不同极性溶剂对鸡血藤有效成分进行提取,测定了鸡血藤不同极性段提取物对鸡大肠埃希菌、鸭大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌等常见病原菌的体外抑菌效果。结果表明,鸡血藤的各种提取物对鸡大肠埃希菌的抑菌圈直径均小于13 mm,属低度敏感;对鸭大肠埃希菌有较好的抑制作用,属中度敏感,其抑菌圈直径大于13 mm,小于19 mm;对金黄色葡萄球菌为高度敏感,其抑菌圈直径在19 mm以上。鸡血藤微波提取物对鸡大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强,700 mL/L乙醇提取物对鸭大肠埃希菌的抑菌作用最强,最小抑菌浓度均为15.63 mg/mL。

鸡血藤;提取物;体外抑菌;最小抑菌浓度

鸡血藤为豆科植物密花豆的干燥藤茎[1]。鸡血藤为传统中药,具有补血活血、舒筋活络的功能,其化学成分复杂,具有广泛的药理作用。临床上常用鸡血藤或与其他药物组方治疗各种原因引起的白细胞减少症、再生障碍性贫血、原发性血小板减少性紫癜、急性肠炎、坐骨神经痛、颈椎病、类风湿性关节炎及各型红斑狼疮、乳腺囊性增生等,均取得了较好的效果[2]。鸡血藤主要含有异黄酮类如芒柄花素、芒柄花苷、卡亚宁等[3]。据报道,黄酮类化合物具有高效、低毒的抗肿瘤活性,但人们对鸡血藤中大多数黄酮类化合物的药理活性知之甚少[4-5]。本试验采用不同极性溶剂获得鸡血藤不同极性段提取物,并进行了鸡血藤提取物体外抑菌试验的初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡血藤、青霉素、链霉素购自南宁市太华医药公司;鸡大肠埃希菌,鸭大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌由广西大学动物科学技术学院药理实验室提供;仪器设备主要有中药材粉碎机,恒温水浴锅,电子天平,烧瓶,培养皿,离心机,恒温培养箱。

1.2 方法

1.2.1 鸡血藤提取物的制备

1.2.1.1 水提取物 将鸡血藤用中药粉碎机磨成粉状。称取鸡血藤粉末20 g,加水煎煮3次,每次90 min。分别过滤,合并 3次滤液。将滤液以3 000 r/min离心30 min,上清液蒸发浓缩(100℃水浴)至 20 mL(浓度 1 g/mL)。115℃高压灭菌15 min,置-4℃保存备用。

1.2.1.2 微波提取物 将鸡血藤用中药粉碎机磨成粉状。称取鸡血藤粉末20 g,加入200 mL蒸馏水,置于微波样品处理系统,于100℃处理15 min。将所得的提取液3 000 r/min,离心30 min,弃沉渣。上清液蒸发浓缩(100℃水浴)为 20 mL(浓度1 g/mL)。115℃高压灭菌15 min,置-4℃保存备用[6]。

1.2.1.3 水煎醇提物 称取鸡血藤粉末20 g,加水煎煮3次,每次90 min。分别过滤,合并3次滤液。将滤液以3 000 r/min,离心30 min,弃去沉渣。上清液蒸发浓缩(100℃水浴)至 60 mL。加入950 mL/L乙醇进行醇沉,使乙醇含量为800 mL/L,静置24 h。过滤,滤液以3 000 r/min,离心30 min。上清液用旋转蒸发仪回收乙醇。乙醇回收基本完全时,用蒸馏水定容至20 mL混悬液(浓度1 g/mL)。115℃高压灭菌15 min,置-4℃保存备用[6]。

1.2.1.4 丙酮提取物 称取鸡血藤粉末20 g,用600 mL/L丙酮浸提3次(每次加入丙酮200 mL),提取间隔时间为48、24、24 h。合并 3次的浸提液,用3层纱布过滤。滤液3 000 r/min离心30 min,弃沉渣。上清液用旋转蒸发仪回收丙酮。丙酮回收基本完全时,用蒸馏水定容至20 mL混悬液(浓度1 g/mL)。115℃高压灭菌15 min,置-4℃保存备用[6]。

1.2.1.5 乙醇分级提取 参照文献[6],称取鸡血藤粉末3份,每份20 g,分别用950,700,450 mL/L的乙醇溶液浸提 3次(每次加入相应 950,700,450 mL/L的乙醇溶液200 mL),提取时间分别为48,24,24 h。合并3次的浸提液,用3层纱布过滤。滤液3 000 r/min离心30 min,弃沉渣。上清液用旋转蒸发仪回收乙醇。乙醇回收基本完全时,用蒸馏水定容至20 mL混悬液(浓度1 g/mL)。115℃高压灭菌15 min,置-4℃保存备用。

1.2.1.6 鸡血藤中黄酮类定性鉴定

(1)醋酸镁试验(10 g/L醋酸镁甲醇溶液)。将供试样品液点于滤纸上,喷10 g/L醋酸镁甲醇溶液,加热干燥后,在紫外灯下观察,二氢黄酮显天蓝色荧光,黄酮,异黄酮类则显黄色→橙色→褐色。称取少量固体样品于试管中,加入甲醇1 mL～2 mL,在水浴中加热溶解,加10 g/L醋酸镁甲醇溶液试剂2滴～3滴,呈颜色反应[7]。

(2)盐酸锌粉反应。取样品(固体)少许于试管中,加50 mL/L乙醇 2 mL,在水浴中加热溶解,滴加浓盐酸数滴,再加锌粉约50 mg,在泡沫处呈桃红色则表明含有黄酮。或取水浸液3 mL～4 mL,在蒸发皿中蒸干,再加950 mL/L乙醇1 mL,加热溶解,不溶物不用过滤,在试管中加入锌粉适量(约50 mg),再加入浓盐酸数滴,在泡沫处呈桃红色即为阳性。

(3)浓氨水试验。将样品点于滤纸上在浓氨水瓶口上熏,立即显荧光,灯下产生极明显的黄色荧光斑点,即含黄酮类。

1.2.2 鸡血藤各种提取物体外抑菌试验

1.2.2.1 培养基准备 营养琼脂平皿和营养肉汤按常规方法制备。

1.2.2.2 菌液的制备 将保存的菌种先接种营养琼脂平板,于37℃培养24 h。(甲)用麦氏比浊管法,将细菌稀释为3亿个/mL的备用菌液;(乙)将细菌接种于牛肉汤中,于37℃培养18 h后,备用。

1.2.2.3 鸡血藤提取物药敏试验 采用纸片扩散法[8]。在制作好的营养琼脂平皿的底面用蜡笔划出6个等区,然后用灭菌棉签蘸取(甲)备用菌液在琼脂表面均匀涂布。用灭菌小镊子取纸片浸入药液中,使其充分浸透后取出,然后将纸片对号贴在平皿划区的中央。每种药液重复做3次,最后将平皿倒置于37℃恒温箱中培养12 h～18 h后取出,量取抑菌圈直径。求出每种药液抑菌圈直径的平均值。其结果的判定标准:抑菌圈直径D≤8为不敏感,8 mm＜D≤13 mm的为低度敏感,13 mm＜D≤19 mm为中度敏感,D＞19 mm为高度敏感。

1.2.2.4 鸡血藤提取物最小抑菌浓度MIC的测定 取灭菌试管10支并编号,按1～10的编号排列于试管架上,按无菌操作要求分别加入牛肉汤0.5 mL。用吸管吸取药液(1 g/mL)0.5 mL放入第1管,并反复吹匀。从第1管吸取0.5 mL放入第2管,同样吹匀后吸出0.5 mL,放入第3管。依此法逐管进行稀释至第9管,第10管不加药液作为对照管。各管均加入(乙)备用菌液0.5 mL,放入37℃培养箱中培养24 h后,观察细菌生长情况。细菌不生长的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。

2 结果

2.1 鸡血藤中黄酮类定性鉴定结果

依据3项定性试验结果综合分析表明,鸡血藤各种极性提取物中均含有黄酮类物质,水煎醇提物、600 g/L丙酮提取物、950 mL/L乙醇提取物和700 mL/L乙醇提取物黄酮类呈阳性,水提取物、微波提取物、450 mL/L乙醇提取物中黄酮类呈弱阳性(表1)。

表1 鸡血藤中黄酮类定性鉴定结果Table 1 Identification of flavonoids in extracts of Reticulate millettia

2.2 鸡血藤提取物药敏试验结果

以链霉素、青霉素为对照药物,测定了鸡血藤的各种提取物分别对鸡大肠埃希菌、鸭大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果(表2)。

结果表明,鸡血藤各种提取物对鸡大肠埃希菌的抑菌圈均小于13 mm,属低度敏感;对鸭大肠埃希菌有较好的抑制作用,属中度敏感,且不同溶剂提取物的抑菌作用不同;对金黄色葡萄球菌为高度敏感,大多数抑菌圈直径在19 mm以上。与对照药物比较,鸡血藤的各种提取物的抑菌效果均低于链霉素、青霉素的抑菌效果。

2.3 鸡血藤提取物最小抑菌浓度(MIC)

测定了鸡血藤的各种提取物分别对鸡大肠埃希菌、鸭大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(表3)。结果表明鸡血藤的各种提取物对鸡大肠埃希菌、鸭大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果。鸡血藤微波提取物对鸡大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用最好。鸡血藤700 g/L乙醇提取物对鸭大肠埃希菌的抑菌作用最好,最小抑菌浓度都为15.63 mg/mL。

表2 鸡血藤提取物体外抑菌试验结果Table 2 T he antibacterial activity of ex tracts of Reticulate millettia in vitro

表3 鸡血藤提取物最小抑菌浓度MIC的测定Table 3 The MIC determination of extracts of Reticulate millettia in vitro

3 讨论

鸡血藤有效成分以异黄酮类如芒柄花素,芒柄花苷,卡亚宁及毛蕊异黄酮等为主[9]。本试验采用水提取法、水提醇沉法、950、700 、450 mL/L乙醇梯度提取法、600 mL/L丙酮提取法和微波提取法,获得了鸡血藤不同极性段提取物。水是中药提取中常用提取溶剂,中药中的生物碱类、苷类、有机酸类、鞣质、蛋白质、多糖类和无机盐都能用水提出,且提取成本低、速度快,但水提取物所含成分复杂多样,不易把握,而且不易分离。乙醇是生物碱、苷类、挥发油、内酯、树脂、鞣质、有机酸和叶绿素等成分的良好溶剂,较水提取液不易发霉、变质,回收浓缩比较方便,容易处理,但所提取出成分与乙醇浓度有很大关系。950 mL/L乙醇作为溶剂提取出的成分主要是生物碱类、挥发油、树脂和叶绿素;600 mL/L～700 mL/L的乙醇适用于苷类的提取;400 mL/L～500 mL/L的乙醇提取的主要是强心苷类及鞣质;200 mL/L～300 mL/L的乙醇则适用于蒽醌及苷类的提取。丙酮作为有机溶剂,也常用于药物有效成分的提取。从鸡血藤提取物中黄酮类定性鉴定结果来看,不同溶剂对其黄酮类成分的溶解存在一定的差异,鸡血藤水提醇沉提取物、700 mL/L乙醇提取物及600 mL/L丙酮提取物中含黄酮类较其他提取物多。

本试验结果表明,鸡血藤的各种提取物对鸡大肠埃希菌均具有一定的抑制作用;对鸭大肠埃希菌有较强的抑制作用,且不同溶剂提取物的抑菌作用有差异;鸡血藤的各种提取物对金黄色葡萄球菌为高度敏感。鸡致病性大肠埃希菌引起的大肠埃希菌病是影响养鸡业生产的常见疾病之一[10],金黄色葡萄球菌是目前引起畜禽上呼吸道感染的常见病原菌[11-12]。在临床上,抗生素的广泛使用和滥用加速了菌株对药物耐药性的产生,造成用药剂量越来越大,治疗成本增加,而且还引起药物残留。寻找新的抗菌药物是解决细菌耐药性问题的重要途径[13]。中药具有毒副作用小、药物残留低、不易产生耐药性等特点,对其进行合理地开发和利用具有重要意义和广阔应用前景。鸡血藤提取物含天然植物抗菌活性成分,提取鸡血藤有效成分,开发为新一代的中药抗菌产品,将会有广阔的市场前景。

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Preparation and Anti-bacterial Activities of Extracts fromReticulate millettia

H U Ting-jun,HE Cai-mei,ZHONG Jing

(College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China)

Water,acetone or different concentrations of alcohol were used to extract different dissolvent ofReticulate millettia.The bacterial grow th inhibition testin vitrowas performed to evaluate bacteriostasis of the seven kinds of extracts.The result showed that the seven kinds of extracts revealed weak anti-bacterial activities on chickenEscherichia coliwith the diameters of inhibition zone less than 13 mm.T he seven kinds of extracts had significantly antibacterial actions on duckE.coliwith the bacteriostasis circle diameters between 13 mm and 19 mm.The most of seven kinds of extracts had significantly antibacterial actions onStaphylococcus aureuswith the bacteriostasis circle diameters larger than 19 mm.The extracts by microwave method had better antibacterial activities onStaphylococcus aureusthan other extracts.The extracts by 70%alcohol revealed the best antibacterial activity with minimum inhibitory concentration of 15.63 mg/mL.

Reticulate millettia;extracts;antibacterial activityin vitro;minimum inhibitory concetration

S853.1

A

1007-5038(2010)09-0033-04

2010-01-15

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻0992014-6);广西“新世纪十百千人才工程”专项资金项目;广西大学科研基金资助项目(X071026)

胡庭俊(1965-),男,甘肃兰州人,教授,博士,主要从事中兽药研究。