吡柔比星局部消融治疗兔移植性VX2肝肿瘤的疗效探讨

张巍 周石 蒋天鹏 斯光晏 郭剑星 吴晓萍

肝癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，手术切除是目前治疗肝癌的最佳手段，但大多患者在就诊时已处于中晚期，已丧失手术机会，仅有9%～27%的患者适宜手术。因此对于大多数患者来说局部消融（Percutaneus local ablative therapy,PLAT）等方法成为主要选择[1－3]。近年来国内外学者先后开展了许多局部消融治疗,其主要是在超声、CT、MRI引导下或直视下穿刺，将治疗探头插入肿瘤病灶内，通过物理或化学效应使肿瘤组织坏死，是目前治疗肝癌的一种重要的微创治疗手段[4-5]。近年有学者尝试将化疗药物采用经皮注射的方式注射到肿瘤局部，以起到抑制肿瘤生长，促进其细胞凋亡、坏死，同时降低化疗药所致的副作用。吡柔比星(吡喃阿霉素，Pirarubicin，THP) ，具有毒副作用小，抗癌谱广泛、活性强的特点，因此在肿瘤治疗中得到了广泛应用。关于将其采用局部消融的方法，直接穿刺注射到肿瘤局部来治疗肝癌的相关文献报道较少。

本实验目的在于通过比较吡柔比星（THP）和无水乙醇采用局部消融方法治疗兔VX2移植性肝癌的疗效,来为临床肝癌介入治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 VX2荷瘤兔（重庆医科大学实验动物中心提供），日本大白兔（贵阳医学院动物实验中心提供），2.5～3kg，雌雄不限。德国Simmons公司AX Axiom Artis FA血管造影机，ALOKA Prosound SSD-5000SV超声仪, 超液化碘油（含碘38%，法国Guerbet公司），无水乙醇(国产，分析纯)，吡柔比星(THP，深圳万乐公司)，2.5%戊巴比妥钠（国产），VEGF试剂(武汉博士德公司)，SABC试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的制作[6-8]将VX2荷瘤兔用2.5%戊巴比妥钠按1ml/kg体重经兔耳缘静脉缓慢注入麻醉，于剑突下作纵行切口，暴露肝脏肿瘤，切取该包块边缘生长旺盛的鱼肉样瘤块，剪成大小相近(1mm×1mm×1mm)的组织块，置RPMI-1640培养液中备用。实验动物麻醉及暴露肝脏同前，用眼科镊将肝左中叶轻牵拉出体外，将肝左中叶包膜捅一小口，在肝脏内打一隧道。用眼科镊取备用的瘤组织块植入隧道底部，再用明胶海绵轻压隧道表面及入口处至彻底止血，缝合切口。术后给予庆大霉素4万U/只/日，肌注，连续三日。两周后于超声下观察证实肿瘤是否生长成功,并记录肿瘤大小、回声特点及有无液化坏死区域的出现及范围、肿瘤的最大径（a）及最小径（b），并记录兔子体重。

1.2.2 动物的分组及处理 两周后经超声检查后，挑选荷瘤兔，将其分成三组，每组8只。A组为空白对照组8只，麻醉开腹暴露肝脏肿瘤（方法同前），不做任何治疗，后逐层缝合关腹。B组8只为THP组，将THP和少量超液化碘油混合后，麻醉开腹暴露肝脏肿瘤，以1毫升空针吸取吡柔比星（2mg/kg）与少量超液化碘油混悬液直视下缓慢注入肿瘤中，在X线透视下监测有无逸出到血管中及是否肿瘤充分填充，采取多点注射。最后用明胶海绵彻底压迫确认无出血及药液逸出后逐层缝合关腹。C组8只为无水乙醇组，乙醇注射量由肿瘤的最大直径确定，即肿瘤最大直径的厘米数等于无水酒精注射的毫升数[9-10]。将无水乙醇与少量超液化碘油混合。麻醉开腹暴露肝脏肿瘤，在透视下给予辅助监测，直视下以一毫升空针吸取无水乙醇与超液化碘油混悬液直视下缓慢注入肿瘤中，最后用明胶海绵彻底压迫确认无出血及药液逸出后逐层缝合关腹。（图①②）

1.2.3 观察指标及方法 (1) 一般情况 治疗后精神、活动、进食状态、毛发情况及两周后兔子体重变化；(2) 治疗后两周超声下记录肿瘤大小，肿瘤体积大小按照V=1/2ab2（a为最大径，b为最小径），计算肿瘤生长率，肿瘤生长率（growth rate，GR）=V治疗后/V治疗前*100%；(3) 处死兔子，10%的福尔马林固定，石蜡包埋切片，每份标本在肿瘤最大层面作2～3张病理切片,光镜观察并用图像采集系统采集图像。结合光镜观察和采集图像的测量,计算出肿瘤坏死区域和整个肿瘤的面积，二者之比即为肿瘤组织坏死率；(4) 组织病理学表现，包括大体变化，转移情况，HE染色观察肿瘤及周边正常肝组织变化，VEGF抗体免疫组化测定肿瘤区VEGF表达强度，VEGF阳性表达表现为肿瘤胞浆内棕黄色颗粒状染色区，每张切片先在低倍镜下全面观察，选定VEGF表达最强处，后在高倍镜下进一步观察统计。阳性结果判定根据以下两方面的总分进行判断：①选染色均匀的阳性表达肿瘤区域，以阳性细胞所占百分比为分级计分：0%为0分，＜25%计为1分，26%～50%计为2分,＞50%计为3分。②按染色强度来分：阴性(0分)，淡黄色(1分)，黄色(2分)，棕黄色(3分)。两个值相加，0～2分计为阴性(-)，3～6分计为阳性(+)[11]。以上方法均由两名病理医师采用双盲法独立检测，取平均值。

1.3 统计学处理 所有数据表达均采用均数+标准差，计量资料比较采用方差分析。组间差异采用x2检验。统计学分析使用SPSS11.0统计软件，P＜0.05差异有显著意义。

2 结果

2.1 一般情况 各荷瘤兔均能耐受治疗过程,手术中多数无水乙醇治疗组兔子出现呼吸深快、心跳快，注射量大者明显。治疗后5天内无水乙醇组多数兔子进食状况、活动、毛发状况均较吡柔比星组及空白对照组差。5天后空白对照组兔子出现明显进食差，毛发脱落及光泽减退，行为迟钝。8天后吡柔比星组也出现明显上述情况，这时三组中相比较空白对照组最为明显。各组均出现体重下降，治疗后两周观察体重变化如表:

2.2 治疗后两周计算肿瘤生长率、坏死率

2.3 组织学变化

2.3.1 治疗两周后处死兔子，取肝脏肿瘤标本，见肝内移植性VX2肿瘤呈白色鱼肉样，质地硬，呈浸润型生长。其中空白对照组中多数出现肝内、大网膜等邻近器官转移和血性腹水；沿肿瘤最大径剖开见部分出现液化坏死。无水乙醇组中部分出现肿瘤与邻近器官粘连，大网膜等邻近器官有转移，其中有3例出现血性腹水，沿肿瘤最大径剖开见部分有凝固性坏死，部分肿瘤中心出现液化。吡柔比星组中有2例出现肝内转移及血性腹水，其余均为巨块型癌结节；沿肿瘤最大径剖开见部分肿瘤中心出现液化。

2.3.2 HE染色观察组织学变化（图③④⑤⑥）

2.3.3 VEGF抗体免疫组化测定肿瘤区VEGF表达强度（每只兔子在肿瘤边缘取两个点切片），结果表明THP组的阳性率为25.0%(4/16)，无水酒精组的阳性率为62.5%(10/16)，采用SPSS11.5软件包行x2检验，P＜0.05，比较有统计学差异。（图⑦）

表1：

表2：

3 讨论

对肝癌的治疗目前早期手术仍是最佳选择，但大约80%患者发现时已丧失手术机会。对于大多数患者来说经动脉灌注化疗及局部消融治疗成为首选，局部消融治疗作为一种微创治疗，近些年来获得迅猛发展。

自1983年日本学者Sugiura等首先报道应用经皮无水酒精注(percutaneous alcohol injection，PEIT)治疗肝癌以来，其在临床上得到广泛应用。无水乙醇主要通过使细胞脱水、蛋白质变性发生凝固性坏死，继而发生纤维化，另外进入肿瘤血管使内皮细胞坏死，血小板聚集，微血栓形成，造成肿瘤缺血性坏死[5-9]。但是PEIT需要多次注射才能发挥疗效。 此外，较大的肿瘤组织内多有纤维分隔，质地不均匀，影响乙醇扩散，这样就影响了对于较大肿瘤的治疗效果，同时也增加了治疗副反应。另外对于乙醇过敏的患者不适合行乙醇注射治疗[12－13]。

图① 开腹见肝左中叶有鱼肉样肿瘤组织呈浸润型生长

图②开腹在直视下向瘤内注射无水酒精（吡柔比星）与碘油的混悬液，透视下监测，尽可能充填瘤体，避免逸出到血管内

图③ 镜下见癌细胞呈浸润生长，与周围组织分界不清，细胞核大而浓染，核分裂象多见。(HE×100)

图④ 镜下见肿瘤病灶发生凝固性坏死,细胞核浓缩、碎裂、溶解，病灶周围均有残余癌巢((HE×100)

图⑥在无水酒精组中,可见肿瘤周围正常肝组织凝固性坏死，肝细胞轮廓尚存，细胞核浓缩、碎裂、消失，坏死边缘见明显充血出血带((HE×100)

图⑤ 镜下见肿瘤周围肝组织中见肝细胞脂肪变性((HE×400)

图⑦ VEGF表达阳性，胞浆内较多棕黄色颗粒。

近年来不少学者尝试将化疗药物采用经皮注射的方式注射到肿瘤局部，以起到抑制肿瘤生长，促进其细胞调亡、坏死。理论上来说，瘤内注射细胞毒药物可获得局部药物高浓度，但是，药物很快进入血循环而不能达到高浓度的目的。目前临床上许多学者采用将碘油做为载体，化疗药与碘油混合后在肿瘤局部缓慢释放作用，这样一方面便于术中监测和术后复查，另一方面药物可以在肿瘤局部较好的发挥作用来杀灭肿瘤细胞[14]。在肝癌治疗中蒽环类抗肿瘤抗生素一直是重要的抗肿瘤药。但由于阿霉素(ADM)等蒽环类药物可导致严重的心肌损害，使其在临床应用上受到限制。自1979年日本的梅泽滨夫等报道了阿霉素衍生物吡柔比星(吡喃阿霉素，pirarubicin，THP)，具有毒副作用小，抗癌谱广泛、活性强的特点，因此THP在肝癌治疗得到了广泛应用。

在对浅表移行细胞癌的治疗研究中发现，用THP膀胱内滴注与ADM相比较，膀胱内滴注后，膀胱癌移行上皮暴露于局部高浓度药物中，THP更有能力穿透细胞而引起更多的吸收，产生更强的效应。局部用药大大提高了肿瘤中药物浓度，最大程度发挥抗癌作用，促使癌细胞坏死，瘤体内丰富的血管闭塞，组织液化坏死，纤维组织增生。因此根据THP细胞渗透作用强，局部给药方式则可使瘤体内药物浓度增高，抗癌作用强，而且由于仍有小剂量药物弥散出瘤体，故对周围小卫星结节亦有同样的作用，可起到区域性化疗的目的[15]。

本实验中我们将无水乙醇和THP分别与超液化碘油混合到一起，这样一方面可以通过透视观察注药的范围，另一方面THP与碘油混合后，可以提高局部药物浓度，在局部持续的发挥作用，能够更好地杀灭肿瘤，对其周围的卫星瘤灶也有杀灭作用[15]。从实验过程来看，THP治疗组在治疗后8天内的进食、活动反应、毛发方面优于无水酒精治疗组。且治疗后两周体重下降幅度小，具有统计学意义。探讨其原因考虑是因为无水酒精注射后有较大的刺激性，另外少量的渗漏也会刺激肝包膜等，注射后兔子反应较大，术中可见兔子的呼吸、心率加快。临床上为达到充分消融，我们常将肿瘤周围正常的肝组织也进行消融，对肝功能损伤较大。实验中为充分消融我们采用多点注射，这样注射量需要加大，所产生的副作用也大，并且药液从针道渗出的机会就大大增加。从处死动物后标本的肉眼和镜下观察看到对正常肝组织也有损害，肿瘤边缘正常肝组织也出现坏死，引起肝功能的损伤较大。另外无水乙醇注射也会对周围脏器有所损害，因为会有少量的无水乙醇从注射的针眼中渗出，会损害周围脏器。从实验中我们也看到部分兔子治疗后解剖观察出现了与周围脏器如胃、大网膜等粘连，而且这些粘连又为肿瘤的转移增加了机会。另外由于肿瘤间有纤维分隔，影响酒精在肿瘤内的弥散，难以达到充分消融，所以会有残留癌灶，会使肿瘤进一步生长。临床上为达到良好的治疗效果，常需要对患者采取多次、重复注射，在本动物实验中由于兔子的耐受情况不能多次手术，我们两组动物均采用了一次注射，但比较其疗效是有意义的。THP通过碘油为载体在肿瘤局部缓慢发挥作用，而在全身其他脏器的血药浓度很低，并且其性质温和，弥散性好，因此所引起的全身副作用也就大大降低，从而THP组兔子的进食、反应等一般情况要好的多。另外因为THP在局部发挥作用，对肿瘤周围包括我们看不到的卫星灶也有杀灭作用，因此我们治疗后14天解剖后看到THP组大多为孤立的巨块型肝癌，周围的转移灶较无水酒精组少。同时，治疗后无水酒精组的进食、活动、体重等下降程度大于THP组。

另外在治疗中通过超声观察无水酒精治疗后肿瘤血供较治疗前明显减少，这符合无水酒精的消融原理，注射无水酒精后立即发生凝固性坏死。治疗两周后病理检查显示肿瘤的坏死率略优于THP治疗组，但不具有统计学意义。但在肿瘤生长率方面无水酒精组仍大于吡柔比星治疗组，我们考虑原因为肿瘤间有较多的纤维分隔，限制了肿瘤的弥散，从而对消融效果造成了影响，另外无水酒精消融需要多次消融才能取得较好的效果，而由于兔子的耐受情况，本实验中无法对兔子进行多次消融，造成了残留癌灶进一步的生长、转移，影响了治疗效果。THP组中治疗后血供减少不明显，但是其能造成肿瘤细胞凋亡，抑制其生长，这是由其抗癌机制决定的，THP能直接嵌入DNA双键或抑制DNA聚合酶，抑制DNA复制与转录，在G2期中止细胞周期，促进细胞调亡，另外THP通过碘油为载体在肿瘤局部缓慢发挥作用，虽然治疗中会有少量的药物渗出，但是其依然对肿瘤周围的卫星灶其到杀灭作用。另外我们在实验结果表明THP治疗组的VEGF表达强度弱于无水酒精治疗组，这又为我们对THP抑制肿瘤生长提供了一个线索。

VEGF是一种多功能细胞因子，能选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种酪氨酸激酶受体，它具有促进内皮细胞分裂、增殖和血管构建，内皮细胞和单核细胞迁移，诱导蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子表达。这样VEGF降解血管内皮细胞的基质、削弱血管的屏障作用，致使新生血管基底膜缺损加重，更利于癌细胞的进入，为肿瘤的侵袭和转移创造条件。研究表明[16-20]：VEGFmRAN的表达在肝癌细胞的生长中起着重要的作用；VEGF基因的表达水平与肿瘤血管染色, 肿瘤的增殖性及门静脉癌栓的形成呈正相关；血清VEGF水平可能是HCC转移的生物学标记。实验中因为肿瘤中心大多为坏死，所以我们取肿瘤边缘组织测定VEGF表达的阳性率，通过比较我们发现THP治疗组的VEGF表达强度弱于无水酒精治疗组。相应的THP组肿瘤的生长率要小于无水酒精治疗组。另外通过大体观察，在大网膜等邻近器官转移及血性腹水的出现机会方面要少于无水酒精治疗组。而无水乙醇组则对VEGF水平的下调作用不是很明显。从本实验的结果来看，我们认为THP具有下调VEGF的表达水平的作用，此可以认为是THP抑制肿瘤生长的原因之一。

4 结论

通过本实验我们看到，THP作为一种有效的抗肝癌的化疗药通过局部消融治疗兔移植性VX2肝肿瘤，在抑制肿瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡、下调VEGF表达水平方面表现出一定的效果。但是本实验仅限于动物实验观察结果，其有些发生机制还有待进一步研究。在临床中我们可以将其用来治疗少血供性肝癌、经供血动脉注入药物困难和经动脉化疗栓塞后尚有部分区域药物沉积不理想的患者。

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