六神丸抗肿瘤血管生成的实验研究

孙莉

新生血管既是恶性肿瘤快速增长所必须的先决条件，亦是恶性肿瘤向远处转移的一个主要步骤和渠道，以肿瘤血管形成为靶点的抗转移研究己成为基础和临床研究的热点，阻断肿瘤血液输送，防治肿瘤新生血管形成的血管生成抑制剂为抗肿瘤生长及转移药物研究提供了新的方向。六神丸是临床治疗肿瘤的有效复方，本实验选择六神丸作为研究对象，拟研究其在肿瘤新生血管的生成中作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系 MCF-7人乳腺癌瘤株，购自山东大学医学院细胞生物学教研室。

1.2 主要试剂及试剂盒 鼠抗人VEGF单克隆抗体(北京岳泰生物公司)，鼠抗人MMP-9单克隆抗体(北京岳泰生物公司)。

1.3 动物含药血清制备及实验分组 Wistar大鼠20只，雄性，体重(200±20)g。随机分为空白血清组(对照组)8只，含药血清制备组12只。含药血清组每日给予六神丸溶液(5 mg/ml)3ml/次，2次/d灌胃，空白血清组每日给予等量生理盐水灌胃，于给药第3天，于末次灌药前12 h禁食，末次给药后1 h，乙醚麻醉，腹主动脉采血，无菌分离血清，经56℃、30 min灭活处理，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后分装，分装入小瓶，置-20℃冰箱保存备用。实验分组，见表1。

表1 实验分组情况

1.4 细胞培养 复苏人乳腺癌细胞系MCF-7细胞，接种于50 ml培养瓶，加入DMEM培养液(含10%小牛血清，青、链霉素各100 u/ml)8 ml，置于37℃、饱和湿度、含5%CO2的细胞培养箱中无菌培养，细胞呈贴壁生长。至细胞生长旺盛贴壁后，去掉原培养液，分别加入以上各对照组、实验组含药血清，于培养箱中继续培养24 h，制备单细胞悬液，加入鼠抗人VEGF单克隆抗体或鼠抗人MMP-9单克隆抗体，上流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 六神丸对人乳腺癌MCF-7细胞的VEGF表达的影响，见表2。

表2 六神丸对人乳腺癌MCF-7细胞的VEGF荧光表达强度的影响

从上表可以得出:对照组(10%正常鼠血清组)及各处理组细胞培养24 h后，各处理组VEGF荧光表达强度水平均有所下降，六神丸含药血清组下降明显，20%含药鼠血清组较10%含药鼠血清组更为明显;DDP+10%正常鼠血清组较之对照组也有明显下降，但不及六神丸含药鼠血清组;DDP+10%含药鼠血清组的荧光表达强度最低。VEGF荧光表达图显示:对照组的VEGF荧光表达强度波峰显著右移，荧光强度高，经各含药血清作用后，VEGF的荧光表达强度波峰显著左移，DDP+10%含药鼠血清组波峰左移最为明显，荧光强度值显著下降。

2.2 六神丸对人乳腺癌MCF-7细胞的MMP-9表达的影响，见表3。

表3 六神丸对人乳腺癌MCF-7细胞的MMP-9荧光表达水平的影响

从上表可以得出:对照组(10%正常鼠血清组)及各处理组细胞培养24 h后，各处理组MMP-9荧光表达强度水平均有所下降;六神丸含药血清组下降明显，20%含药鼠血清组较10%含药鼠血清组更为明显;DDP+10%正常鼠血清组荧光表达强度较对照组明显下降，但不及10%及20%含药鼠血清组下降明显;DDP+10%含药鼠血清组的荧光表达强度最低。荧光表达图显示:对照组的MMP-9荧光表达强度波峰显著右移，荧光强度高，经各含药血清作用后，MMP-9的荧光表达强度波峰显著左移，DDP+10%含药鼠血清组波峰左移最为明显，荧光强度值显著下降。

结果表明:各处理组VEGF及MMP-9荧光表达强度明显下降，与正常鼠血清组比较差异显著;六神丸含药鼠血清对MCF-7细胞VEGF及MMP-9荧光表达有明显抑制作用，且随药血清浓度升高抑制作用增强;DDP+10%含药鼠血清组的抑制作用最强，说明含药鼠血清与DDP合用有增效作用。

3 结论

正常情况下血管内皮细胞是稳定的，当受到生理或病理的刺激如创伤、缺氧或肿瘤生长时开始增生以形成新的血管。新生血管形成包括毛细血管内皮层下基底膜降解、内皮细胞迁移和增殖、新生血管形成和新的基底膜形成等一系列过程。肿瘤血管生成必须依赖于瘤细胞、间质细胞、巨噬细胞及周围宿主细胞分泌相关的血管生成活性因子诱导刺激内皮细胞增殖、迁移，导致血管新生。新血管的形成、发展及调节取决于血管生成促进因子(正调节)和血管生成抑制因子(负调节)之间的平衡。当促进血管生成的正调节因子占优势时，就导致血管增生，反之就被抑制。在正常组织中，血管形成是受到严格调控的，由于血管新生的正负调节因子处于平衡状态，即促血管生长因子被高水平的血管生成抑制因子严格控制，血管生成的开关处于关闭状态，血管内皮细胞维持稳定。肿瘤细胞诱导血管形成是通过改变血管生成因子和血管抑制因子之间的平衡来实现的。一旦平衡遭到破坏，导致肿瘤组织中生长因子过度表达，抑制因子表达过低，肿瘤血管生成的开关将被打开，使得肿瘤组织完全倾向于血管生成一方，最终导致肿瘤的浸润和转移。VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，也是目前己知作用最强的促血管内皮细胞增殖的细胞因子。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，其主要功能是降解细胞外基质中起骨架作用的主要成分，在肿瘤介导的细胞外基质降解中起关键作用。因此，MMP-9与VEGF协同表达可作为血管生成与肿瘤侵袭转移的标志。

本实验以流式细胞计数法测定 MCF-7细胞 VEGF、MMP-9表达。结果显示，六神丸含药鼠血清能显著抑制VEGF、MMP-9的表达，高浓度的鼠药血清优于低浓度血清组，DDP单用能显著下调VEGF、MMP-9表达，但不及六神丸鼠药血清组，而DDP+10%六神丸鼠药血清组抑制作用最明显。六神丸是攻毒法的代表方剂，是临床治疗肿瘤的有效复方。选择六神丸作为研究对象，从抗肿瘤血管生成方面立意，探讨其抗肿瘤作用的机理，丰富了六神丸在肿瘤治疗中的内涵，对肿瘤的临床治疗有重要的指导意义。