酶法制备大豆多肽的研究

吕育新

（哈高科大豆食品有限责任公司，哈尔滨150086）

大豆蛋白与乳、肉和鸡蛋等动物蛋白相比具有较高的价格优势，但由于大豆蛋白质分子结构复杂，分子量较大，分子高度压缩、折叠，从而使其消化率和生物效价远不及动物蛋白。

蛋白质的酶解是改善蛋白质特性的一种很好的方式，大豆蛋白质经蛋白酶水解后生成大豆多肽和大豆寡肽，更易被人体消化吸收；另外，大豆肽还具有多种生理功能和较高的营养价值。因此，大豆蛋白水解物通过选择不同种类的蛋白酶、控制水解度的大小，可以得到具有不同生理活性的肽，这一领域是目前国内外研究的热点［1-3］。本实验确定了Alcalase碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最佳条件，提出了采用Alcalase酶和Flavourzyme酶双酶法分步酶解工艺来生产低苦味大豆多肽的方法，并得到了分子量不同的多肽产物。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

大豆蛋白（哈高科大豆食品有限责任公司）、Alcalase酶（丹麦 NovoNordisk公司提供）、Flavourzyme酶（丹麦NovoNordisk公司提供）

1.2 实验方法

1.2.1 分析方法 Alcalase蛋白酶的酶活力测定方法：参照QB/T1803-1993蛋白酶活力的测定方法；

Flavourzyme风味酶活力测定方法：参照QB/T1803-1993蛋白酶活力的测定方法；

DH值(水解度)测定方法：采用pH-stat法，计算公式为：

式中：B为消耗碱量；

N为NaOH摩尔浓度；

α为大豆蛋白氨基的平均解离度0.44；

h为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，对于大豆蛋白h=7175。

氨基酸态氮的测定方法：参照ZBX66014-87。

1.2.2 大豆蛋白预处理 大豆蛋白溶液在90℃温度下加热处理约10min，使大豆蛋白致密的立体结构变得松散，有利于提高大豆蛋白的酶解速率。

1.2.3 大豆蛋白的酶解反应操作 称取大豆蛋白加入适量水配制成一定浓度的大豆蛋白溶液，经恒温水浴预处理后，调节温度至反应温度，根据文献［4，5］，调节pH值至该反应的最适pH值8.0，加入一定量Alcalase碱性蛋白酶，在反应温度下进行恒温酶解，酶解过程中要不断搅拌，同时滴加0.1mol/L的NaOH溶液以保持反应体系pH值恒定，反应偏差一般控制在±0.1。每隔15min记录NaOH用量，并以水解度加以比较，待水解结束后在搅拌条件下迅速升温至90℃灭酶，酶解液用于Flavourzyme风味酶的酶解研究。

1.2.4 利用单因素试验确定水解条件

1.2.4.1 水解温度的确定 在底物浓度为6%，酶与底物浓度比为2%不变的情况下，水解温度分别为40℃，50℃，60℃，70℃，水解大豆蛋白 120min；以水解度为评价指标确定最佳的水解温度。

1.2.4.2 底物浓度的确定 在上述最佳的水解温度条件下，酶与底物浓度比为2%，底物浓度分别为4%，6%，8%的情况下水解大豆蛋白120min；以水解度为评价指标确定最佳的底物浓度。

1.2.4.3 酶与底物浓度比的确定 在上述最佳温度和底物浓度的条件下，酶与底物浓度比分别为2%、4%、6%的情况下水解大豆蛋白120min；以水解度为评价指标确定最佳的酶与底物浓度比。

1.2.5 Flavourzyme风味酶的酶解 当大豆蛋白水解反应后，得到浅棕色半透明液体。该溶液呈现出苦味。采用Flavourzyme酶继续水解8h，可以有效的减少水解液的苦味，水解完成后冷却用4000r/min的转速离心10min，取上清液于试管中，置冰箱中备用。

1.2.6 水解产物肽分子量的确定

1.2.6.1 测定条件 紫外检测波长为280nm，洗脱液的pH值为4.0，用0.0175mol/L磷酸二氢钠加入0.1mol/L HCl进行调节，流速为0.4mL/min，加入样量为0.6mL。

1.2.6.2 分析方法 取已经预处理好的交联葡萄糖凝胶（G25）装柱，并用洗脱液处理2个柱体积后，然后加入样品0.4mL，用记录仪记录其流出吸收情况，计算出相应的流出体积。

分别取氧化型谷胱甘肽（Mw=612），维生素(B12=1355)，胰岛素(Mw=5733）1mg，溶于 5mL 洗脱液中，按上述操作进行分析，并确定各种物质最大吸收峰时洗脱液的流出体积（mL）。

以氧化型谷胱甘肽（Mw=612），维生素(B12=1355)，胰岛素(Mw=5733）为分子量参照物，以各种物质分子量对数值为纵坐标（lgM），最大吸收峰时洗脱液的流出体积（mL）为横坐标做标准曲线，称取水解产物干品50mg，用蒸馏水定容到5mL，过葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)柱，用记录仪记录其流出液吸收情况，计算出相应的流出体积。根据标准曲线求出相应的分子量。

2 实验结果与分析

2.1 Alcalase酶和Flavourzyme风味酶的酶活

Alcalase酶的酶活：6.9×104U/g；Flavourzyme风味酶的酶活：1.4×104U/g

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 温度对水解度的影响 本试验在底物浓度为6%，酶与底物浓度比为2%不变的条件下，控制水解温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃，在pH值8.0±0.1条件下水解120min。

从实验数据中可看出水解度与水解温度呈正相关，在70℃时水解度达到最大。但由于在70℃时水解过快，pH下降也很快，很难使pH值维持在8.0±0.1，另外根据Alcalase碱性蛋白酶酶学特性，如果温度继续升高，高温会使酶失活，导致蛋白酶水解能力下降，由此确定Alcalase碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最适温度为60℃。

2.2.2 底物浓度对水解度的影响 控制水解温度为60℃，酶与底物浓度比2%不变，维持水解液的pH 8.0±0.1，采用的底物浓度分别为4%、6%、8%，水解大豆蛋白120min。以大豆蛋白的水解度为指标，确定Alcalase碱性蛋白酶单酶水解大豆蛋白的最佳底物浓度。

由实验结果可知，在相同的水解时间条件下，底物浓度越低水解度越大。这是由于底物浓度过高，体系流动性差，不利于酶与底物的接触。因此，认为底物浓度为4%时效果较好。

2.2.3 酶与底物浓度比对水解效果的影响 控制水解温度60℃，大豆蛋白水解溶液pH 8.0±0.1，底物浓度4%，采用酶与底物比分别为2%、4%、6%的条件下进行水解，水解120min。以大豆蛋白的水解度为指标，确定最佳的酶与底物浓度比。

由实验结果可知，虽然酶与底物比为6%时，蛋白质的水解程度最大，但是6%的酶与底物比生产成本较高。当反应达到平衡时，酶与底物比为2%和4%时的水解度仅比6%时小约5%。因此，从生产成本上考虑，选用酶与底物比为2%。

2.3 水解产物的分子量确定

2.3.1 标准曲线的制备 各种标准样品的分子量与最大洗脱体积见附表，并按最大洗脱体积对各物质分子量的对数值（l gM）作图，得到标准曲线（见图1）。

附表 标准分子量的流出体积

图1 标准曲线

2.3.2 水解产物的分子量分析 取经过Flavourzyme酶水解4h、8h的水解产物上清液各2mL，过葡聚糖凝胶（SephadexG-25）柱，用记录仪记录其流出液吸收情况，记录最大洗脱体积出现时的时间，则最大洗脱体积可以通过洗脱流速与洗脱时间的乘积求得。

图2 水解4h产物洗脱时间分布图

图3 水解8h产物洗脱时间分布图

分析条件为：检测波长280nm，洗脱液：pH=4.0的磷酸缓冲液，流速：0.4mL/min，温度：室温，加样量：5mL。

两组溶液分别得到的最大洗脱时间如图2、图3所示，并由上述标准曲线求得所得肽的分子量，比较Flavourzyme酶水解时间对产物分子量的影响。

由图2和图3可知，随着水解时间的延长，水解程度的加深，肽平均分子量逐渐降低，说明水解度增大后，大肽分子数量减少，使肽平均分子量降低。当水解4h时，得到三种肽的出峰时间，分别约为120、150和 160min，肽分子量分别约为 471、2858、2425；当水解8h后，所得多肽的最大出峰时间约为149min，肽分子量约为2865，其余小肽出峰不明显，说明随着水解时间的延长，水解产物分子量变小，水解得更彻底，这时候大豆多肽多以寡肽形式存在，易于被人体消化吸收。

3 小结

（1）Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白的较佳条件为：Alcalase碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最适温度为60℃；底物浓度为4%；酶与底物比为2%。

（2）向上述水解反应后的水解液中加入560U/g的Flavourzyme酶，实验结果发现：随着水解时间的延长水解液中氨基酸态氮含量增加，根据感观评定，水解液苦味变淡。

（3）通过对水解产物的分子量分析，实验结果发现：随着水解时间的延长，水解产物分子量变小，水解得更彻底，这时候大豆多肽多以寡肽形式存在。

［1］刘健敏，钟芳，麻建国.大豆生理活性肽的研究(1)-酶法水解的工艺［J］.无锡轻工大学学报，2004，3:41-45.

［2］安毅，张君文.大豆蛋白活性肽在功能性食品中的应用及发展前景［J］.大豆通报，2004，4:27-29.

［3］陈成.大豆蛋白活性肽保健功能性的研究［J］.大豆通报，2005，2:22-24.

［4］孙旸，陈光，刘艳秋.Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究［J］.吉林农业大学学报，2005，2:162-166.

［5］吴建中，赵谋明，宁正祥，杨晓泉.酶法水解生产大豆多肽研究［J］.粮油加工与食品机械，2003，1:45-47.

［6］郭维静.玉米蛋白水解制取玉米肽的研究［C］.大连理工大学硕士学位论文,2006,6.