吕育新
(哈高科大豆食品有限责任公司,哈尔滨150086)
大豆蛋白与乳、肉和鸡蛋等动物蛋白相比具有较高的价格优势,但由于大豆蛋白质分子结构复杂,分子量较大,分子高度压缩、折叠,从而使其消化率和生物效价远不及动物蛋白。
蛋白质的酶解是改善蛋白质特性的一种很好的方式,大豆蛋白质经蛋白酶水解后生成大豆多肽和大豆寡肽,更易被人体消化吸收;另外,大豆肽还具有多种生理功能和较高的营养价值。因此,大豆蛋白水解物通过选择不同种类的蛋白酶、控制水解度的大小,可以得到具有不同生理活性的肽,这一领域是目前国内外研究的热点[1-3]。本实验确定了Alcalase碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最佳条件,提出了采用Alcalase酶和Flavourzyme酶双酶法分步酶解工艺来生产低苦味大豆多肽的方法,并得到了分子量不同的多肽产物。
大豆蛋白(哈高科大豆食品有限责任公司)、Alcalase酶(丹麦 NovoNordisk公司提供)、Flavourzyme酶(丹麦NovoNordisk公司提供)
1.2.1 分析方法 Alcalase蛋白酶的酶活力测定方法:参照QB/T1803-1993蛋白酶活力的测定方法;
Flavourzyme风味酶活力测定方法:参照QB/T1803-1993蛋白酶活力的测定方法;
DH值(水解度)测定方法:采用pH-stat法,计算公式为:
式中:B为消耗碱量;
N为NaOH摩尔浓度;
α为大豆蛋白氨基的平均解离度0.44;
h为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数,对于大豆蛋白h=7175。
氨基酸态氮的测定方法:参照ZBX66014-87。
1.2.2 大豆蛋白预处理 大豆蛋白溶液在90℃温度下加热处理约10min,使大豆蛋白致密的立体结构变得松散,有利于提高大豆蛋白的酶解速率。
1.2.3 大豆蛋白的酶解反应操作 称取大豆蛋白加入适量水配制成一定浓度的大豆蛋白溶液,经恒温水浴预处理后,调节温度至反应温度,根据文献[4,5],调节pH值至该反应的最适pH值8.0,加入一定量Alcalase碱性蛋白酶,在反应温度下进行恒温酶解,酶解过程中要不断搅拌,同时滴加0.1mol/L的NaOH溶液以保持反应体系pH值恒定,反应偏差一般控制在±0.1。每隔15min记录NaOH用量,并以水解度加以比较,待水解结束后在搅拌条件下迅速升温至90℃灭酶,酶解液用于Flavourzyme风味酶的酶解研究。
1.2.4 利用单因素试验确定水解条件
1.2.4.1 水解温度的确定 在底物浓度为6%,酶与底物浓度比为2%不变的情况下,水解温度分别为40℃,50℃,60℃,70℃,水解大豆蛋白 120min;以水解度为评价指标确定最佳的水解温度。
1.2.4.2 底物浓度的确定 在上述最佳的水解温度条件下,酶与底物浓度比为2%,底物浓度分别为4%,6%,8%的情况下水解大豆蛋白120min;以水解度为评价指标确定最佳的底物浓度。
1.2.4.3 酶与底物浓度比的确定 在上述最佳温度和底物浓度的条件下,酶与底物浓度比分别为2%、4%、6%的情况下水解大豆蛋白120min;以水解度为评价指标确定最佳的酶与底物浓度比。
1.2.5 Flavourzyme风味酶的酶解 当大豆蛋白水解反应后,得到浅棕色半透明液体。该溶液呈现出苦味。采用Flavourzyme酶继续水解8h,可以有效的减少水解液的苦味,水解完成后冷却用4000r/min的转速离心10min,取上清液于试管中,置冰箱中备用。
1.2.6 水解产物肽分子量的确定
1.2.6.1 测定条件 紫外检测波长为280nm,洗脱液的pH值为4.0,用0.0175mol/L磷酸二氢钠加入0.1mol/L HCl进行调节,流速为0.4mL/min,加入样量为0.6mL。
1.2.6.2 分析方法 取已经预处理好的交联葡萄糖凝胶(G25)装柱,并用洗脱液处理2个柱体积后,然后加入样品0.4mL,用记录仪记录其流出吸收情况,计算出相应的流出体积。
分别取氧化型谷胱甘肽(Mw=612),维生素(B12=1355),胰岛素(Mw=5733)1mg,溶于 5mL 洗脱液中,按上述操作进行分析,并确定各种物质最大吸收峰时洗脱液的流出体积(mL)。
以氧化型谷胱甘肽(Mw=612),维生素(B12=1355),胰岛素(Mw=5733)为分子量参照物,以各种物质分子量对数值为纵坐标(lgM),最大吸收峰时洗脱液的流出体积(mL)为横坐标做标准曲线,称取水解产物干品50mg,用蒸馏水定容到5mL,过葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)柱,用记录仪记录其流出液吸收情况,计算出相应的流出体积。根据标准曲线求出相应的分子量。
Alcalase酶的酶活:6.9×104U/g;Flavourzyme风味酶的酶活:1.4×104U/g
2.2.1 温度对水解度的影响 本试验在底物浓度为6%,酶与底物浓度比为2%不变的条件下,控制水解温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃,在pH值8.0±0.1条件下水解120min。
从实验数据中可看出水解度与水解温度呈正相关,在70℃时水解度达到最大。但由于在70℃时水解过快,pH下降也很快,很难使pH值维持在8.0±0.1,另外根据Alcalase碱性蛋白酶酶学特性,如果温度继续升高,高温会使酶失活,导致蛋白酶水解能力下降,由此确定Alcalase碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最适温度为60℃。
2.2.2 底物浓度对水解度的影响 控制水解温度为60℃,酶与底物浓度比2%不变,维持水解液的pH 8.0±0.1,采用的底物浓度分别为4%、6%、8%,水解大豆蛋白120min。以大豆蛋白的水解度为指标,确定Alcalase碱性蛋白酶单酶水解大豆蛋白的最佳底物浓度。
由实验结果可知,在相同的水解时间条件下,底物浓度越低水解度越大。这是由于底物浓度过高,体系流动性差,不利于酶与底物的接触。因此,认为底物浓度为4%时效果较好。
2.2.3 酶与底物浓度比对水解效果的影响 控制水解温度60℃,大豆蛋白水解溶液pH 8.0±0.1,底物浓度4%,采用酶与底物比分别为2%、4%、6%的条件下进行水解,水解120min。以大豆蛋白的水解度为指标,确定最佳的酶与底物浓度比。
由实验结果可知,虽然酶与底物比为6%时,蛋白质的水解程度最大,但是6%的酶与底物比生产成本较高。当反应达到平衡时,酶与底物比为2%和4%时的水解度仅比6%时小约5%。因此,从生产成本上考虑,选用酶与底物比为2%。
2.3.1 标准曲线的制备 各种标准样品的分子量与最大洗脱体积见附表,并按最大洗脱体积对各物质分子量的对数值(l gM)作图,得到标准曲线(见图1)。
附表 标准分子量的流出体积
图1 标准曲线
2.3.2 水解产物的分子量分析 取经过Flavourzyme酶水解4h、8h的水解产物上清液各2mL,过葡聚糖凝胶(SephadexG-25)柱,用记录仪记录其流出液吸收情况,记录最大洗脱体积出现时的时间,则最大洗脱体积可以通过洗脱流速与洗脱时间的乘积求得。
图2 水解4h产物洗脱时间分布图
图3 水解8h产物洗脱时间分布图
分析条件为:检测波长280nm,洗脱液:pH=4.0的磷酸缓冲液,流速:0.4mL/min,温度:室温,加样量:5mL。
两组溶液分别得到的最大洗脱时间如图2、图3所示,并由上述标准曲线求得所得肽的分子量,比较Flavourzyme酶水解时间对产物分子量的影响。
由图2和图3可知,随着水解时间的延长,水解程度的加深,肽平均分子量逐渐降低,说明水解度增大后,大肽分子数量减少,使肽平均分子量降低。当水解4h时,得到三种肽的出峰时间,分别约为120、150和 160min,肽分子量分别约为 471、2858、2425;当水解8h后,所得多肽的最大出峰时间约为149min,肽分子量约为2865,其余小肽出峰不明显,说明随着水解时间的延长,水解产物分子量变小,水解得更彻底,这时候大豆多肽多以寡肽形式存在,易于被人体消化吸收。
(1)Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白的较佳条件为:Alcalase碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最适温度为60℃;底物浓度为4%;酶与底物比为2%。
(2)向上述水解反应后的水解液中加入560U/g的Flavourzyme酶,实验结果发现:随着水解时间的延长水解液中氨基酸态氮含量增加,根据感观评定,水解液苦味变淡。
(3)通过对水解产物的分子量分析,实验结果发现:随着水解时间的延长,水解产物分子量变小,水解得更彻底,这时候大豆多肽多以寡肽形式存在。
[1]刘健敏,钟芳,麻建国.大豆生理活性肽的研究(1)-酶法水解的工艺[J].无锡轻工大学学报,2004,3:41-45.
[2]安毅,张君文.大豆蛋白活性肽在功能性食品中的应用及发展前景[J].大豆通报,2004,4:27-29.
[3]陈成.大豆蛋白活性肽保健功能性的研究[J].大豆通报,2005,2:22-24.
[4]孙旸,陈光,刘艳秋.Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究[J].吉林农业大学学报,2005,2:162-166.
[5]吴建中,赵谋明,宁正祥,杨晓泉.酶法水解生产大豆多肽研究[J].粮油加工与食品机械,2003,1:45-47.
[6]郭维静.玉米蛋白水解制取玉米肽的研究[C].大连理工大学硕士学位论文,2006,6.