糖尿病肾病大鼠MMP-9/TIMP-1的表达及钙拮抗剂对其表达的影响

王衍慧 黄玉宇 傅君舟 周巧玲

1 广州市第一人民医院老年病科（510080）

2 广州市第一人民医院肾脏内科（510080）

3 中南大学湘雅医院肾脏内科（410008）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的微血管病变并发症之一，细胞外基质(extmeellular matrix，ECM)积聚是发生DN的重要病理机制，最终导致肾纤维化的形成[1]，糖尿病肾组织ECM堆积又与ECM降解酶系统MMP/TIMP相关，MMPs几乎能降解ECM的所有成分，其中MMP-9的作用底物为胶原Ⅳ、Ⅴ、明胶、弹性蛋白等，是肾脏内主要的基质降解酶，其表达量与活性的高低直接影响肾小球ECM的积聚[2]。TIMPs是MMPs的内源性天然抑制因子，有TIMP-1、-2、-3、-4四种亚类，TIMP-1是所有亚类中活性最强的，其特异性抑制MMP-9活性[3]。在DN发生过程中，MMP-9与TIMP-1的关系如何，钙离子拮抗剂（CCB）对DN的保护作用是否与MMP/TIMP有关，本组研究拟通过观察DN模型鼠肾组织中MMP-9、TIMP-1的表达状况，并用CCB硝苯地平进行干预实验，旨在进一步探讨DN时MMP/TIMP在其发病中的作用及CCB对DN保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

苯地平控释片由拜耳公司惠赠。链脲佐菌素（STZ美国Sigma），VEGF抗体(北京中山)，SP法试剂盒、DAB液（福建迈新）；Trizol（美国Invitrogen），逆转录试剂盒（立陶宛Fermentas），MMP9、TIMP1引物由上海生工合成。

1.2 动物模型及分组

选择清洁级Wistar雄性大鼠30只，喂养1周后随机分健康对照（N）组10只、糖尿病组20只，糖尿病模型制备采用STZ 50mg/kg腹腔注射，待大鼠空腹血糖维持在13.9mmol/L或随机血糖16.7mmol/L 1周以上，尿糖阳性则视为糖尿病模型成功。3周后测尿蛋白在30mg/24h以上者，视DN模型成功而纳入实验。DN模型成功后的20只大鼠再随机分为非干预组（DN组，10只）和硝苯地平干预组（T组，10只）。T组大鼠按15mg/（kg·d）剂量灌胃，DN组每日以等量清水灌胃。硝苯地平干预前、后均测量平均尾动脉压（MAP）。于2周和4周各组均分别处死5只，处死前1天收集24h尿标本，检测尿蛋白排泄量。从心脏取血离心后保存，检测Scr；留取肾组织作RT-PCR检测。

1.3 生化指标检测

尿蛋白量（24h）采用双缩脲法测定。Scr采用饱和苦味酸法测定。

1.4 RT-PCR检测

采用Trizol一步法提取肾组织RNA，提取后-80℃保存。严格按照逆转录试剂盒操作合成cDNA，PCR反应体系为10×Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl2 2.0μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，GAPDH上下游引物各0.4μL，同管中分别加入MMP-9、TIMP-1引物0.4μL及cDNA 1μL，去离子水12μL，Taq酶 1.0μL，终反应体系为20μL。按下列反应条件进行扩增：反应参数为95℃预变性5min，94℃变性60s，退火温度分别是MMP-9 55℃、TIMP-1 53℃、β-action 55℃，72℃延伸60s，共30循环，72℃终末延伸10min，见表1。RT-PCR检测结果半定量分析运用Bandscan 5.0 图像处理系统测量各自产物的吸光度A，得出MMP-9、TIMP-1 mRNA的相对值。进行统计学处理。

1.5 统计学处理

所有研究数据均采用SPSS10.0软件包进行统计学处理，均用均数±标准差（±s）表示。两组均数间的比较采用最小显著差异t检验，P＜0.05时有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠24h尿蛋白排泄、Scr、MAP情况

干预的第2、4周，DN组鼠24h尿蛋白排泄量、Scr、MAP 较N组明显增加，T组3者比DN组显著下降（P＜0.05），见表2。

表1 RT-PCR测定引物序列

表2 各组大鼠生化指标及血压值（±s）（n=5）

表2 各组大鼠生化指标及血压值（±s）（n=5）

与N组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与DN组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

2.2 各组大鼠肾组织中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达情况

N组肾组织中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA出现微量表达，2周时DN组的MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达有增高趋势，T组的MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达较N组和DN组有增高趋势（P＞0.05），4周时DN组的MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达较N组明显增高，T组增高更显著（P＜0.01），见图1、2。

图1 MMP-9 mRNA表达状况

图2 TIMP-1 mRNA表达状况

2.3 MMP/TIMP mRNA比值分析

DN组肾组织中的MMP-9/TIMP-1 mRNA半定量比值较N组明显降低（P＜0.05）。T组的MMP-9/TIMP-1 mRNA半定量比值较DN组明显升高（P＜0.01）。

3 讨 论

DN最核心的问题是ECM的聚集，ECM降解减少是导致其聚集的主要原因之一，MMP/TIMP是参与ECM降解的主要酶系[4]，肾内高糖环境与MMP/TIMP酶活性程度密切相关。本研究结果显示，DN组鼠肾组织MMP-9、TIMP-1的表达较N组明显增高。而MMP-9/TIMP-1的比值较N组明显下降，可能的机制是：在DN早期高糖刺激系膜细胞后基质合成分泌旺盛，早期ECM的一些成分作为ECM分泌的负反馈调节机制，激活MMP/TIMP，从而促进系膜细胞及基底膜ECM的降解[5]。而DN中晚期可能ECM成分和性质变化使这种负反馈调节机制受到破坏，继而出现MMP/TIMP基因转录改变，MMP/TIMP比值出现相应变化，促进肾纤维化行程与发展。MMP/TIMP酶系在不同调控水平对高血糖的反应存在差异，目前仍是一个有争议的问题[6]。本研究的结果说明DN中ECM降解的趋势已减弱，DN向肾纤维化进展，MMP-9/TIMP-1比值的变化较单纯的MMP-9、TIMP-1表达水平变化可能更能说明DN疾病进展的过程。

近年来，在DN的治疗中，尽管CCB的应用一直是有争论的问题，但随着研究的进展，二氢吡啶类CCB非血流动力学的肾脏保护作用颇受临床医生的重视，有学者认为它能减轻肾脏肥大，改善肾小球系膜对大分子物质转运，拮抗生长因子有丝分裂作用，减少氧自由基形成，促进一氧化氮生成，抑制血小板聚集，减轻肾钙质沉着，及减低残存肾小管细胞代谢活性等[7]。本组研究用硝苯地平干预后发现DN大鼠平均动脉收缩压明显下降，同时大鼠24h尿蛋白明显减少；DN组大鼠肾组织MMP-9/TIMP-1比值较模型组显著升高，通过本组研究说明：一方面，CCB可降低DN鼠的高血压，这是二氢吡啶类CCB通过改变肾小球血流动力学效应而实现的；另一方面CCB可直接或间接促使MMP-9/ TIMP-1比值升高，纠正MMP/TIMP失衡，纠正ECM合成与降解失衡，减少ECM的积聚，改善肾纤维化，达到保护保护肾脏的作用。有关CCB对DN的肾保护作用，本文仅做一初探，其确切机制仍需长时期、大样本的临床试验才能得到证实，但本研究为今后DN发病机制探讨及抗肾小球纤维化治疗提供了一定的理论参考。

[1] Anderson SS,Wuk J,Nagase H,et al.Effect of matrix glycation on expression of typeIV collagen,MMP2,MMP9 and TIMP-1,by human messangial cells[J].Cell Adhesion Commun,1996,4(1):89-101.

[2] Suzuki D,Miyazaki M,Jinde K,et al.In situ hybridization studies of matrix metalloproteinase-3,tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and type Ⅳ collagen in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int,1997,52(1):111-119.

[3] Gomez DE,Alonso DF,Yoshiji H,et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases structure,regulation and biological functions[J]. Eur J Cell Biol,1997,74(2):111-122.

[4] Staskus PW,Masiarz FR,Pallanck LJ,et al.The 21-kDa protein is a transformation- sensitive metalloproteinase inhibitior of chicken fibroblasts[J].J Boilchem,1991,266(1):449-454.

[5] Wakisaka M,Spiro MJ,Spiro RG,et al.Sythesis of type IV collagen by cultured glomerular cells and comprison of its regulation by glucose and other factors with that of type V collagen[J]. Diabetes,1994,43(1):95-103.

[6] Mclennan S,Martell SY,Yue DK. High glucose concentration inhibits the expression of membrane type metalloproteinase by mesangial cells: Possible role in mesangium accumulation[J].Diabetologia,2000,43(5):642-648.

[7] 谌贻璞.双氢吡啶类钙拮抗剂的肾脏保护作用[J].中国医药导刊,2000,2(4):8-10.