北京地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及防治对策

周 涛, 师迎春, 陈笑瑜, 范在丰

(1.中国农业大学植物病理学系,农业部植物病理学重点实验室,北京 100193;2.北京市植物保护站,北京 100029)

番茄黄化曲叶病毒病是危害世界许多地区番茄生产的一种毁灭性病害,分布广泛,已给热带和亚热带地区的番茄生产造成严重损失。近年来该病在我国由南向北快速扩展,浙江、广东、广西、上海、江苏、山东、安徽等地均报道发生[1-9],2009年在北京市大兴区发现表现典型黄化曲叶症状的番茄植株[10]。该病的典型症状为叶片变小黄化,卷曲,边缘亮黄色,节间缩短,植株矮化,花朵减少,开花延迟,坐果少而小,成熟期果实转色不正常,且成熟不均匀。该病在番茄生长各阶段均可发生。苗期发病,植株严重矮缩,不能开花结果,造成绝收;植株生长后期发病,上部叶片和新芽表现典型黄化卷曲症状,坐果急剧减少,果小且畸形,严重影响产量和品质。

番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)为双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员,寄主有番茄、曼陀罗、辣椒、菜豆、烟草等[11]。传毒介体为烟粉虱,同时可经嫁接传播,不能经机械摩擦或种子传播。烟粉虱在作物和蔬菜以及杂草上发生十分普遍,为害茄科、葫芦科、豆科等多种植物。烟粉虱获毒后终生带毒,但不经卵传给下一代。在保护地栽培条件下,烟粉虱在北方能够安全越冬并周年发生,成为导致番茄黄化曲叶病快速扩展和大流行的重要原因。

北京市保护地面积达1.3万hm2,其中番茄是保护地主栽蔬菜之一。2009年夏天在北京郊区调查番茄病毒病时,发现有些温室的番茄植株表现典型黄化曲叶症状,且烟粉虱发生严重。采回发病番茄样品,提取总DNA经PCR检测和测序鉴定为番茄黄化曲叶病毒病。这是该病毒病在北京地区发生的首次分子检测鉴定报道。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2009年9-10月在北京郊区大兴、通州、昌平、房山、密云、顺义、延庆县的日光温室和大棚中采集表现典型植株矮缩、顶部叶片黄化上卷症状的番茄叶片样品,整理后分别存放在4℃冰箱和-20℃冰箱。

1.2 叶片总DNA的提取

利用CTAB方法快速提取番茄叶片总DNA。取0.1g番茄叶片样品,液氮中充分研磨,转入2mL离心管后,加入65℃预热的600μL2%CTAB抽提缓冲液(2%CTAB,200mmol/LTris-HCl,140mmol/LNaCl,40mmol/LEDTA,1%PVP,pH8.0),混匀后于 65 ℃温育30min,再用 600μL氯仿抽提两次后,上清液中加入等体积的异丙醇,取沉淀经 70%乙醇洗涤,干燥后溶于 TE中,于-20℃保存。

1.3 PCR扩增、克隆和序列测定

根据谢艳等[12]报道的检测粉虱传双生病毒的简并引 物 PA(5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′)和 PB(5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′)(K=G或T;W=A或T;V=A,C或G;S=C或G;Y=C或T;R=A或G;B=C,T或G)进行PCR,扩增双生病毒基因间隔区和部分外壳蛋白基因约500bp的特异片段,并进行克隆和序列测定。

建立25μLPCR反应体系：番茄叶片总DNA 2 μL,dNTPs(10mmol/μL)0.5 μL,上游引物 PA 、下游引物PB各0.5μL,10×反应缓冲液2.5μL,Taq DNA 聚合酶0.25μL(5U/μL),ddH2O18.75μL。

PCR反应条件：94℃变性2min,按下列条件进行32个循环(94℃变性30s,55℃复性45s,72℃延伸30s),72℃延伸10min。全部PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,切取约500bp的目标条带,用凝胶回收试剂盒回收纯化后,克隆到pMD18-T载体(TaKaRa)。阳性克隆经验证后送华大基因公司测序。

1.4 序列分析

利用 NCBI序列比对工具 BLAST(http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序 nucleotideblast比对分析克隆获得的序列,根据相似性明确病毒种类。

2 结果与分析

2.1 样品检测

以提取的总DNA为模板,利用粉虱传双生病毒通用引物PA/PB进行PCR检测,结果是表现典型症状的番茄样品均扩增出约500bp的条带,和TYLCV阳性对照样品的扩增结果一致(图1)。共检测了25个番茄样品,其中21个样品带有双生病毒,检出率为84%。结果表明北京市郊区种植的番茄已被烟粉虱传播的双生病毒侵染危害。

图1 部分表现症状番茄叶片的PCR检测结果

2.2 TYLCV北京分离物部分序列分析

将PCR扩增得到的约500bp的片段回收,克隆到pMD18-T载体并进行序列测定。利用NCBI网站上BLAST程序nucleotideblast进行序列相似性检索和分析的结果表明：在检测为阳性的来自北京郊区的番茄样品DNA中扩增得到的双生病毒基因组部分序列,与番茄黄化曲叶病毒分离物JSNJ1和XH2(Gen-Bank登录号分别为FN293161.1,GU111505.1)的序列相似性最高,均为99%,表明北京郊区温室种植番茄已被番茄黄化曲叶病毒感染而导致番茄黄化曲叶病的发生。

3 防治对策讨论

利用PCR方法从北京郊区7个区县采集的番茄样品中检测到了番茄黄化曲叶病毒,该分离物的部分序列与已登录GenBank的分离物JSNJ1和XH2(GenBank登录号分别为FN293161.1,GU111505.1)的序列相似性最高,均为99%,说明番茄黄化曲叶病已经在北京局部发生,这是该病在北京地区发生的首次正式报道。进一步的病情、发生原因和更广泛的调查正在进行中。

根据所获得的北京分离物的序列和比对结果,初步判断北京发生的番茄黄化曲叶病毒病可能来自于从我国南方调运的带毒番茄幼苗。另外,北京周年从南方调运的大批花卉苗木上也有携带病毒和带毒烟粉虱的可能性。以带毒幼苗和带毒烟粉虱为侵染源,经烟粉虱取食扩散导致番茄黄化曲叶病在北京发生。近几年,北京大面积推广保护地栽培生产模式,烟粉虱得以在保护地内安全越冬和周年发生。如不严加防控,可导致该病的快速传播和大面积流行。

防治病毒病最有效的方法是培育、种植抗病品种,而目前我国生产上推广的番茄品种都不抗该病毒病。国外有些品种具有高抗特性,又不适合中国人的口味。因此,从长期来考虑务必要培育符合中国人口味的抗病品种。短期内防治的关键是加强田间栽培管理措施和防治烟粉虱。具体可以参考以下措施：

(1)培育无虫无病幼苗

由于苗期感病后,不仅造成发病植株绝收,且成为植株间快速传播的毒源,所以务必培育无粉虱无病毒病的番茄幼苗。育苗床应与生产大田分开,苗床尽量选用近年来未种过茄科和葫芦科作物的土壤,对育苗基质及苗床土壤进行消毒处理,以减少虫源;采用40～60目防虫网隔离育苗以避免苗期感染病毒;苗床内在植株顶端高度下5cm悬挂黄色黏虫胶板,诱杀烟粉虱以减少传毒媒介。移栽前7d棚室杀虫处理。

对外地调运的幼苗,特别是从发病区调运的幼苗,务必在调运前委托具有病毒检测能力的大学等研究机构进行抽样快速检测,若幼苗中检测到该病毒,建议不要调运。

(2)强化田间防控措施

幼苗移栽前全棚内杀虫处理,棚室所有通风处均使用40～60目防虫网覆盖,门口设置缓冲门道,内外门错开并且避免同时开启。以防带毒的烟粉虱进入棚室内。

发现病株或疑似病株,务必及时拔除深埋(＞40cm)。及时清除田间杂草和残枝落叶减少虫源和毒源。发病初期,症状可能与缺素症、普通花叶病毒病相混淆而引起更严重的损失,务请及时与当地植保部门联系。

促进番茄植株健壮生长,增施磷钾肥,保持田间湿润,肥水管理要少量多次,提高植株耐病能力。适当调整种植时间,由于烟粉虱在早春4～5月份从温室迁飞到露地为害,秋季9～10月份从露地迁回温室越冬为害,因此调整幼苗移栽时间以避免苗期染毒,减轻病害发生。

由于烟粉虱繁殖能力强,扩散迅速,具有突发性、爆发性和毁灭性为害等特点,建议植保部门在集中连片种植番茄和相关茄科、葫芦科和豆科作物的地区进行统防统治,减少发病和未发病田块之间的烟粉虱近距离传播从而提高防治效果。冬季或春季种植番茄,气温较低,烟粉虱发生少,活动性不强,是控制该病传播和彻底防治烟粉虱的最佳季节。

生产中如遇虫口上升迅速需及时采用药剂应急防治,可选用25%噻虫嗪水分散粒剂5000～6000倍液喷雾或25%噻嗪酮可湿性粉剂1500倍与2.5%联苯菊酯乳油3000倍混合喷雾。喷药时务必均匀喷到叶片正面和背面,特别着重对叶片背面喷药。因烟粉虱繁殖力强,极易产生抗药性,需要几种药剂交替混配使用。气温较高或保护地内温度较高时,烟粉虱活动活跃,一般5～7d喷药1次,温度较低时可10～15d防治1次。

[1]刘玉乐,蔡健和,李冬令,等.中国番茄黄化曲叶病毒——双生病毒的一个新种[J].中国科学(C辑),1998,28(2)：148-153.

[2]周雪平,彭燕,谢艳,等.赛葵黄脉病毒：一种含有卫星DNA 的双生病毒新种[J].科学通报,2003,48(16)：1801-1805.

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[10]李明远.番茄黄化曲叶病毒病传入北京,番茄生产面临威胁[J].植物保护,2009,35(6)：179-180.

[11]Plant Viruses Online,Descriptions and lists from the VIDE database.Tomato yellow leaf curl bigeminivirus[EB/OL].http：∥pvo.bio-mirror.cn/descr840.htm.

[12]谢艳,张仲凯,李正和,等.粉虱传双生病毒的 TAS-ELISA及PCR快速检测[J].植物病理学报,2002,32(2)：182-186.