加压素在妊娠期高血压疾病大鼠下丘脑视上核和室旁核内的表达

孙惟靖 于红 任慕兰 张露青

妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorders in pregnancy)是妊娠期特有的疾病，是孕产妇及围生儿死亡的重要原因之一。妊娠期高血压疾病的基本病理生理改变为全身小动脉痉挛，引起外周循环阻力增加、血压升高[1]。妊娠期高血压疾病病因复杂，发病机制迄今尚不完全清楚，多认为可能与子宫胎盘供血不足、免疫和神经内分泌因素有关[2]。

有研究表明妊娠期高血压疾病时，内皮细胞受损，加压素(vasopression，VP)、血管紧张素Ⅱ、肾上腺素、胰岛素等传递介质被激活，调节内皮因子的释放[3]。VP由下丘脑产生，经纤维投射至垂体后叶释放，参与体液调节以及心血管系统、腺垂体的功能调节，并与痛觉的调制有关。妊娠期高血压疾病能导致多系统并发症[4-5，7]，然而在中枢神经系统的变化，尤其是心血管中枢的改变却鲜有报道。本实验利用亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)建立妊娠期高血压疾病模型，研究在妊娠期高血压疾病病理生理过程中母体脑内的心血管调节核团下丘脑视上核(SON)、室旁核(PVN)内加压素(VP)含量的变化。为进一步研究中枢对心血管活动的调节机制，以及VP在妊娠期高血压疾病的发病过程中的作用提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及妊娠期高血压疾病动物模型的制备 用L-NAME(江苏省南通碧云天生物技术研究所)阻断一氧化氮(NO)合成可使孕鼠产生妊娠期高血压疾病特征及相应的病理生理改变，本研究采用此方法制备妊娠期高血压疾病动物模型[6-8]。10周龄SD雌性大鼠12只(中国科学院上海实验动物中心)，(180±10)g，在相同环境下用正常饲料喂养。按雌雄2∶1合笼，次日根据阴道涂片镜检，以发现精子作为妊娠第1天。受孕后随机分为两组，每组6只。(1)模型组：从孕13d至分娩每日皮下注射L-NAME 250mg/kg；(2)正常妊娠组，从孕13d至分娩每日皮下注射生理盐水。另取6只未孕雌鼠作为对照组。血压测量：室温20℃，3组大鼠在清醒状态下，于每日上午9时用尾筒法测定尾动脉收缩压和舒张压，直至分娩。计算平均动脉压，取其平均值(舒张压+1/3脉压)。结果用均数±标准差(±s)表示。尿蛋白测定：分别于妊娠第12～20天用标准代谢笼收集孕鼠24h尿量，以考马斯亮蓝结合法[8]测定尿蛋白浓度。仔鼠测量：剖宫取仔，记录胎鼠数， 测胎鼠体重。行为观察：初步观察孕晚期孕鼠的行为是否异常，如行动减少、反应迟缓、目光呆滞、面部抽搐等。

表1 各组大鼠平均动脉压、尿蛋白含量和胎鼠体重(±s)

表1 各组大鼠平均动脉压、尿蛋白含量和胎鼠体重(±s)

注：与正常妊娠组和对照组比较*P＜0.05；与正常妊娠组比较#P＜0.05

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表2 各组大鼠SON和PVN内VP阳性神经元数目(±s)

表2 各组大鼠SON和PVN内VP阳性神经元数目(±s)

注：与正常妊娠组和对照组比较*P＜0.05；与正常妊娠组和对照组比较#P＞0.05

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图A SON主部VP免疫阳性神经元的分布(ABC免疫组化染色，×200)。标尺=80μm图B SON尾部AVP免疫阳性神经元的分布(ABC免疫组化染色，×200)。标尺=80μm图C PVM亚核内VP免疫阳性细胞的分布(ABC免疫组化染色，×200)。标尺=80μm图D PVL亚核内VP免疫阳性细胞的分布(ABC免疫组化染色，×200)。标尺=80μm

1.2 取材与切片 于妊娠21d戊巴比妥钠麻醉下，剪开胸腔，将穿刺针自心尖处进针，刺入升主动脉，用小止血钳钳夹固定，剪开右心耳，先用生理盐水250mL快速灌注至肝脏就成灰白色，再用4%中性多聚甲醛溶液200mL灌注固定。灌注固定后取鼠脑，置4%多聚甲醛固定48h，再依次用20%、30%的蔗糖溶液脱水。取材将含SON和PVN的组织块在冰冻切片机中作连续冠状切片(厚30μm)。

1.3 免疫组织化学染色 切片经正常羊血清(l∶50)处理30min，兔抗VP血清(l∶5000，美国Chemicon公司)4℃孵育12h，PBS漂洗，ABC免疫反应，二氨基联苯胺(DAB)溶液(0.05 ∶0.01%，北京中山生物技术有限公司)室温孵育约15min，PBS漂洗终止反应。对上述切片脱水封片，光镜观察、摄片、并在高倍镜下计数。

1.4 细胞计数和统计学方法 采用Leica LAS图像分析系统(德国Leica公司)分析。实验数据均应用SPSS10.0软件进行统计学处理，统计结果用均数±标准差(±s)表示，显著性水平设为α=0.05。

1.5 对照实验 另取1只SD鼠脑冠状连续切片，分2套分别作如下对照试验：①空白试验：省去免疫组化染色中兔抗VP血清，孵育切片。②置换试验：用正常兔血清代替VP免疫组织化学染色中的兔抗VP血清。

2 结果

2.1 妊娠期高血压疾病指标的测定 妊娠期高血压疾病大鼠出现行动减少、反应迟缓等异常行为，同时出现血压、尿蛋白升高，胎鼠宫内发育迟缓等一系列病理学变化，与人类妊娠期高血压疾病的症状相似。妊娠期高血压疾病组平均动脉压为明显高于对照组和正常妊娠组(P＜0.05)。给药组孕鼠尿蛋白浓度显著增加(表1，P＜0.05)，胎鼠体重降低(P＜0.05)。见表1。

2.2 对照实验结果 空白试验和置换实验均不出现相应的阳性反应结果，表明本实验无抗体交叉反应存在。

2.3 SON内VP阳性神经元的形态与分布 光镜下SON细胞群密集分布于大脑底部视交叉(OC)上方的两侧。核团呈三角形，顶尖向内侧倾斜。镜下妊娠期高血压疾病组和对照组大鼠的SON可见VP阳性细胞群。SON主部(SONm)VP阳性神经元分布较为密集，呈内侧稍宽的带状分布于OC的外上方(图A)。SON尾部(SONr)的阳性细胞沿下丘脑边缘排列，细胞长轴大多一致(图B)。SON内的VP免疫阳性神经元以大细胞型为主，神经元胞体大，核圆形，核仁清楚，核周有浅染区。胞质内可见呈棕黄色的反应颗粒，大小不等，散在于胞质中。妊娠期高血压疾病组阳性细胞数较对照组和正常妊娠组多(表2，P＜0.05)。

2.4 PV N内V P阳性神经元的形态与分布 参照Armstrong[9]对大鼠PVN各亚核的划分标准，结合Paxinos和Watson的《The rat brain in stereotaxic coordinates》[10]图谱，将PVN分为四个大细胞亚核：前连合核(AC)、内侧室旁核(PVM)、外侧室旁核(PVL)、室旁核后亚核(PvPO)。光镜下可见，两组大鼠PVN内VP免疫阳性神经元呈楔形集中分布于第三脑室(3V)两侧。其中PVM(图C)和PVL(图D)亚核细胞数目最多。至PvPO水平AVP细胞数量减少，细胞散在分布于PVL背外侧部。AVP免疫阳性神经元以大细胞型为主，胞体大，以圆形、卵圆形或梭形为主。核圆形，核仁清楚，核周有浅染区。胞质内可见呈棕黄色的反应颗粒散在于胞质中，有的融合成片。免疫阳性神经元染色深浅程度不一。细胞的突起较长。三组大鼠PVN内VP阳性细胞数无明显差异(表2，P＞0.05)。

3 讨论

本实验应用Yallampalli[6]的制模方法建立孕鼠妊娠期高血压疾病模型，L-NAME抑制NO合成后，孕鼠血压明显升高，尿蛋白显著增加，胎鼠体重降低，胎鼠宫内发育迟缓等一系列变化与人类妊娠期高血压疾病的症状及病理生理变化相似，说明妊娠期高血压疾病动物模型是成功的，与文献报道一致[7-8，11]。VP的主要合成部位是SON和PVN。大量的生理学研究资料[12-13]表明VP、催产素(OT)共同参与血压、记忆、性行为及生殖功能的调节。PVN和SON含有大细胞神经元和小细胞神经元，大部分大细胞神经元的轴突从PVN、SON发出后，通过视神经-垂体通路，输送到神经垂体贮存和释放。下丘脑视交叉上核(SCN)、PVN、SON的VP神经元与脑内和心血管调节相关的核团如迷走神经背核、孤束核(NTS)及脊髓中间外侧角发生广泛纤维联系，这是参与心血管活动调节的解剖学依据。研究表明，脑室内注射VP可引起潜伏期很短的血压升高、心率加快。此中枢升压不伴有尿量的改变，并可被静脉注射神经节阻断剂或受体阻断剂所阻断。可见中枢VP的变化对心血管有一定的作用，该作用可能是通过激活中枢交感冲动发放实现的[14]。在中枢，有文献报道正常大鼠和自发性高血压大鼠(SHR)下丘脑有VP阳性神经元分布[15-16]。张师前等[17]的研究证实妊娠期高血压疾病患者血浆VP浓度较正常孕妇明显升高；应用降压药物治疗1～3周后，血浆VP较治疗前明显降低。而对妊娠高血压状态下，脑内VP的分布尚缺乏报道。本研究显示对妊娠期高血压疾病大鼠的脑内心血管核团PVN和SON的研究发现：①妊娠期高血压疾病大鼠的SON和PVN有分泌VP的功能，且细胞形态与正常妊娠大鼠相似。②SD孕鼠SON含有的VP较妊娠期高血压疾病少(P＜0.05)，提示中枢VP含量的异常增加可能与妊娠高血压的发病有关。③本实验从形态学的角度观察了三组大鼠的PVN内VP免疫阳性细胞数目(P＞0.05)，VP在三组大鼠PVN中表达的差异有待进一步作生化指标的测定来验证。

妊娠期高血压疾病的病因及发病机制十分复杂，本实验初步研究了VP在下丘脑心血管核团中的表达情况，为进一步从蛋白和分子水平上探讨妊娠期高血压疾病的发病机制和VP的作用提供形态学资料。

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